第四节目的基因。
基因工程之。
基因工程的操作过程。
基因工程技术★★★
基因工程是生物技术的核心部分。
基因工程的操作可以简述如下：
基因工程的操作流程。
基因工程的操作包含以下步骤：
纯化。蛋白质产物的分离。
表达。转化或转染。
重组 dna 分子。
获得目的基因构造。
重组dna技术操作的主要步骤。
将外源基因(又称目的基因，是一段 dna 片断)组合到载体 dna 分子中去，再把它转到受体细胞(亦称寄主细胞)中去，使外源基因在寄主细胞中增殖和表达，从而得到期望的由这个外源基因所编码的蛋白质。
基因工程的基本操作：
目的基因主要是指。
编码蛋白质的结构基因。
dna重组基本程序包括下列过程）
切—获取目的基因和载体。
接—目的基因与载体的连接。
转—重组dna导入宿主细胞。
筛—重组dna的筛选与鉴定。
分别取出质粒和dna
用同一种限制酶切断dna
用连接酶连接目的基因。
将重组dna分子导入受体细胞。
细胞增殖并产生目的基因的产物。
一、目的基因的获得。
基因工程主要是通过人工的方法，分离、改造、扩增并表达生物的特定基因，以获得有价值的基因产物。目的基因的分离是基因工程操作的第一步。
切—获取目的基因。
获得目的基因的途径。
一）基因组文库或cdna文库法；
二）化学合成法；
三） pcr法；
四）限制性酶切法……
通常，我们把插入到载体内的非自身的dn**段称为“外源基因”(foreign gene)。
目的基因(objective gene)：又叫靶基因(target gene)，是指根据基因工程的目的，设计的所需要的某些dna分子片段，它含有一种或几种遗传信息的全套密码(code)
目的基因(objective gene)：
基因文库。p39
基因组dna文库(genomic dna library)
存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组dna的集合。
cdna文库：
以mrna为模板，利用反转录酶合成与mrna互补的dna，再复制成双链cdn**段，与适当载体连接后转入受体菌，即获得cdna文库(cdna library)
含有一种生物的全部基因。
含有一种生物的部分基因。
构建基因文库的目的：筛选出感兴趣的目的基因。
基因组dna文库的构建。
将总dna经过酶解，经蔗糖梯度离心或琼脂糖凝胶电泳分离不同长短的dn**段。包含的基因组片段分别克隆在质粒或噬菌体载体上，转染细菌或体外包装到噬菌体颗粒上便构成了该生物的基因组文库。
抽提基因组dna
制备dn**段。
dn**段与载体重组。
转化宿主菌。
筛选目的基因。
核酸探针法、免疫结合法）
构建流程。建立基因library
ligase
a plasmid library
after transformation
反转录人工合成互补dna, cdna
反转录人工合成互补dna方法的优势——
获取的dn**段往往是具有特定功能的目的基因。
第一步分离总rna ,然后从总rna中分离出 mrna部分， 约占细胞总rna的1％-2％。
第二步以mrna为模板，经过逆转录合成第一条cdna。
第三步将mrna-cdna杂交分子转变为双链cdna分子
第四步将合成的双链cdna重组到质粒载体或噬菌体上
第五步将重组分子转入大肠杆菌主细胞中进行增殖。
cdna文库的构建。
基因组dna文库与cdna文库的比较。
cdna文库的基因表达的时空性决定cdna文库的取材，构建cdna文库时最好选取目的基因表达量最高的发育时期或这一时期的特殊组织。
根叶花花药茎穗下节幼胚。
gamyb1）基因组文库克隆的是任何基因，包括未知功能的dna序列；cdna文库是克隆的具有蛋白质产物的结构基因包括调节基因。
2）基因组文库克隆的是全部的遗传信息，不受时空影响cdna文库克隆的是不完全的编码dna序列。因它受发育和调控因子的影响。
3）基因组文库中的编码基因是真实基因，含有内含子和外显子，而cdna文库克隆的是不含内含子的功能基因(1)
基因组dna文库与cdna文库的比较。
cdna 文库。
1)根据目的基因已知核苷酸序列进行筛选分离(鸟枪法）：
利用一段核苷酸序列 (dna、cdna或寡聚核苷酸) 或抗体作探针 (probe)，用放射性同位素或非放射性同位素标记探针筛选基因库，得到阳性克隆，再对阳性克隆子进行进一步鉴定（测序等）。
一）从基因组文库或cdna文库中分离目的基因。
分子杂交法：
单链dna与其互补的序列总有“配对成双”的倾向，如dna：dna配对或者dna：rna配对，这就是分子杂交的原理。
dna分子杂交原理。
dna分子杂交是基因诊断最基本的方法之一。其基本原理是：互补的dna单链能够在一定条件下结合成双链，即能够进行杂交。
这种结合是特异的，即严格按照碱基互补配对进行。因此，当用一段已知基因的核苷酸序列作为探针，与被测基因进行接触，若两者的碱基完全配对成双链，则表明被测基因中含有已知的基因序列。
利用分子杂交的基本原理既可以分离又可以鉴别某一基因。
样品dna提取→ 变性(加热90℃或调高ph12~12.5) →与另一条已知经放射性同位素或荧光标记的dna(探针，probe)杂交(温度调整为37～60℃) 结果判断(若能稳定形成双链，则表明样品dna与已知dna有同源性)】
两种生物的dna单链之间互补程度越高，通过分子杂交形成双螺旋片段的程度也就越高，二者的亲缘关系就越近；反之，亲缘关系就越远。所以，可以通过dna分子杂交技术来鉴定物种之间亲缘关系远近。
dna探针。
probe）
探针是一段能够与待选目的基因互补的核酸序列。
dna、cdna、寡聚核苷酸
单链、双链放射性同位素(如32p)、荧光分子。
放射性同位素(如32p)标记、荧光分子标记、颜色标记。
一小段用同位素、生物素或荧光染料标标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在硝酸纤维素膜 (nc膜)上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。
将噬菌体感染形成的噬菌斑，印影在硝酸纤维膜上；变性；带有目的基因的放射性dna或cdna作探针进行杂交； 放射性自显影， 杂交信号（黑点）对应的噬菌斑即为阳性克隆。
筛库过程：硝酸纤维素膜。
差别杂交。适用于分离在特定组织中表达的基因、在细胞周期特定阶段表达的基因、受生长因子调节的基因、以及在特定发育阶段表达的或是参与发育调节的基因，用来分离经特殊处理而被诱发表达的基因。
2） 根据目的基因特异性表达进行分离。
二）化学合成法。
是以单核苷酸为原料，在体外用化学方法按照已知基因的碱基顺序合成dna短片段，再依次连接成完整的目的基因链。此法必须预先知道目的基因或其mrna或蛋白质的一级结构，即核苷酸或氨基酸的顺序。
为了保证定向合成，需要将一个分子的5’端与另一个分子的3′端封闭保护。这种封闭可用磷酸化等方法，必要时可以酸或碱解除封闭。
化学合成法的最大优点是能按照人们的意愿合成突变基因。但有局限性，要合成较长链的 dna分子尚有困难。
随着现代科学技术的发展，基因工程操作仪器设备也不断更新。如日本zeon公司已成功制成并**“全自动dna合成仪” ，精工电子工业公司的“ dna序列仪”。
目前单链dna短片段的。
合成已经成为分子生物学。
和生物技术实验室的常规。
技术了。 将需要的基因从供体生物的细胞内提取出来。
取出dna用限制酶切断dna
目前被较广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素基因、种子贮藏蛋白基因、植物抗病基因等。
三）限制性酶切法。
细胞内总dna的提取分离程序。
四）pcr扩增法。
当巳知目的基因的序列时，通常利用多聚酶链式反应(pcr)技术来分离目的基因。
它能快速、简便地在体外扩增特定的dn**段，具有高度的专一性和灵敏度。
pcr 的基本反应步骤。
— 把寻找目的基因和扩增目的基因两步操作并成一步。
pcr 技术★★★
聚合酶链反应(polymerase chain reaction, pcr )又称为pcr扩增技术，是一种高效、快速、特异性的体外dna聚合程序。
2023年，美国pe-cetus公司人类遗传研究室的kary mullis发明了具有划时代意义的pcr技术；
2023年，kary mullis因发明pcr技术获得诺贝尔化学奖。
1. 变性 (denaturation)：
加热使模板dna双链间的氢键断裂而形成两条单链。94℃ 30″
2. 退火 (复性) (annealling):
突然降温后模板dna与引物按碱基配对原则互补结合，也存在两条模板链之间的结合，但由于引物的高浓度，结构简单的特点，主要的结合发生在模板与引物之间。55 ℃ 30 ″
3. 延伸 (extension):
将反应温度调节到酶的最适温度，在dna聚合酶、4种 dntps 及镁离子等存在的条件下，以引物的 3′ 端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的新dna链。72 ℃ 1′
上述 3 步为一个循环，每经过一个循环，样本中的dna量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～40个循环后dna可扩增106 ～ 109 倍。
pcr技术基本反应步骤分三步：
时间（min）
重复1-3步。
25-30轮循环。
目的dn**段
扩增100万倍以上。
dna双螺旋。
dna单链
与引物复性。
dna变性
形成2条单链。
子链延伸 dna加倍。
pcr的基本原理。
温度（℃）pcr的基本原理。
pcr反应条件
pcr过程
pcr的特点。
模板dna高温变性。
pcr的基本原理。
pcr的基本原理。
pcr反应条件
pcr过程
pcr的特点。
引物1引物2
低温退火。pcr的基本原理。
pcr的基本原理。
pcr反应条件
pcr过程
pcr的特点。
引物1引物2
taq酶。taq酶。
适温延伸。pcr的基本原理。
pcr的基本原理。
pcr反应条件
pcr过程
pcr的特点。
第1轮结束。
pcr的基本原理。
pcr的基本原理。
pcr反应条件
pcr过程
pcr的特点。
taqtaq
选修4第二章
选修4第二章 化学反应速率化学平衡 单元测试题。广州市中学化学教研会高二中心组提供。本试卷分选择题和非选择题两部分，共8页，满分150分，考试用时90分钟。第一部分选择题 共90分 一 选择题 本题包括10小题，每小题4分，共40分。每小题只有一个选项符合题意 1 在2a b 3c 4d反应中，表示...
第二章4节
数学建模电子教案。第4次课。课题第二章数学规划模型 2.4动态规划模型教学内容。动态规划模型的建立及求解。1.使学生掌握基本的建立动态规划模型的方法。2.能运用matlab及mathematica软件求解动态数学规划问题。动态规划模型的实际应用动态规划模型的理论讲解。教学目标。教学重点教学难点。双语...
第二章第4讲
考纲要求 1.了解氧化还原反应的本质是电子转移。2.了解常见的氧化还原反应。考点一用分类思想理解氧化还原反应。1 根据反应中有无 转移或元素是否发生变化，可以把化学反应划分。为反应和反应。判断氧化还原反应的最佳判据是。2 四种基本反应类型和氧化还原反应的关系可用下图表示 1 下列反应属于氧化还原反应...