实验方案。
1. 材料和方法。
1.1 菌种。
酿酒酵母假丝酵母的简介。
1.2 培养基。
1.2.1 酵母菌完全培养基（yepd）：2%葡萄糖，1%酵母粉，2%蛋白胨，2%琼脂，蒸馏水。
1.2.2 酵母菌原生质体再生培养基为yepds:2%蛋白胨，1%酵母提取物，2%葡萄糖，17% 蔗糖，蒸馏水。
1.2.3 ttc上层指示培养：
1.7%胰蛋白胨， 0.3%大豆胨， 0.
6%葡萄糖， 0.25%氯化钠， 0.05%硫乙醇酸钠，1.
5%琼脂， 0.025% l－胱氨酸－盐酸(l－cys·hcl), 0.01%亚硫酸钠， 0.
05%(1%氯化血红素溶液), 0.01%(1%维生素k1溶液), 0.04% 2，3，5－氯化三苯四氮唑(ttc)
ttc 的制作方法。
1 除1%氯化血红素、维生素k1和ttc外，将其他成分混合，加热溶解。l－胱氨酸先用少量氢氧化钠溶解后加入，校正ph7.2，然后加入预先配成的氯化血红素和维生素k1，充分摇匀。
装瓶，每瓶100ml。121℃高压灭菌15min，备用。
2 临用前，溶解基础琼脂，每100ml基础培养基中，加入ttc40mg，充分摇匀，倾注无菌平板。
1.3 试剂。
1.3.1 柠檬酸-磷酸缓冲液（cpb）:ph6.0，内含0.6mol/l的蔗糖。
0.2mol/l的磷酸氢二钠的配置方法：
na2hpo4 28.4g
31.61g
na2hpo4.2h2o 35.6g
na2hpo4.7h2o 53.63g
na2hpo4.12h2o 71.64g
加蒸馏水至1000ml
0.1mol/l的柠檬酸的配置方法：
柠檬酸（c6h8o7h2o) 21.01g，加蒸馏水至1000ml
ph=6.0时需12.63ml 0.2mol/l的磷酸氢二钠和7.37ml 0.1mol/l的柠檬酸。
1.3.2 脱壁预处理剂（dwpg）：0.6mol/l的蔗糖，10mmol/l mgso4, 50mmol/l二硫苏糖醇（dtt）。
用量还不清楚。
1.3.3 2%蜗牛酶液，用cpb配制，0.45微米膜过滤除菌。
1.3.4 促融合剂：35%聚乙二醇（mw6000），0.01mol/l cacl2, 0.6mol/l蔗糖。
用量不清楚。
1.4 方法。
1.4.1 原生质体制备：
a酿酒酵母和 b休哈塔假丝酵母各取活化菌种于28度200r/min培养。a培养8h，b培养11h，各取7ml，3000r/min离心5min，无菌水洗两次，cpb洗一次，加入dwpg1ml,28度下预处理20min，4000r/min离4min，弃上清，加入28度预温的2%蜗牛酶液3ml,28min,100r/min摇床振荡0.5-1h。
相差显微镜镜检，当90%以上细胞变为原生质体后，3000r/min离10min，cpb洗两次，离心收集原生质体。原生质体形成率按下式计算：原生质体形成率=(a-c)/(a-c)*100%，式中a为破壁前菌落数；,为破壁后无菌水稀释20倍，静置20min后在完全培养基上生长的菌落数。
1.4.2 原生质体纯化：
制备10% ,25%和40%的蔗糖浓度梯度，将原生质体轻置于上层，3000 r/ min离心10 min，不同浓度界面处有原生质体区带，分别命名为p 10, p25和p40原生质体。（为什么）
1.4.3 原生质体再生：
将所获原生质体分别涂布高渗再生培养基，28度培养3天，计算再生率：原生质体再生率=（b-c）／（a-c）*100%,式中a、c,同前，b为破壁后高渗液适当稀释后涂布高渗平板菌落数。
1.4.4 原生质体融合：
分别吸取采用不同方式进行灭活处理的两种亲本原生质体悬液，按照1:1 的比例混合后，6 000r/min 离心10min，收集原生质体沉淀。向沉淀中小心加入1ml 聚合剂（ 促融合剂），30℃静置保温2h。
随后，再加入5ml yepds 液体培养基r/min 预培养2h。预培养结束后，将其涂布于yepds 固体平板上，30℃倒置培养，待菌落长出。在yepds 固体平板长出的菌落，初步认定即为原生质体融合子。
1.4.5 融合子筛选：向上述待检菌落平皿加入ttc上层指示培养基，置28度条件观察，如1小时内呈现红色菌落者即为融合子。
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