蛋白质组学相关技术的研究进展。
生物111班 2号邬龙祺。
摘要：蛋白质组学是后基因组时代的新兴学科，是当今生命科学领域新的增长点，本文就蛋白质组学中的分离和鉴定技术包括双向凝胶电泳、色谱和质谱等技术近几年的发展状况及最新研究进展进行综述。
关键词：蛋白质组学；双向凝胶电泳；色谱；质谱；生物信息学。
2023年人类基因草图正式发表并于2023年4月最终完成。随着人类基因组计划的实施和发展，生命科学研究已进入了后基因组时代。在这个时代，生命科学的中心任务是阐明基因组所表达的真正执行生命活动的全部蛋白质的表达规律和生物功能，即生命科学的研究重心将从基因组学转移到蛋白质组学。
近几年来，人们对蛋白质组学的认识日益加深，对蛋白质组学的研究也取得了不错的进展，尤其是其研究技术方面取得了空前硕果，而这些成果，必将对人类健康水平的提高产生深源的影响。
一、概念及相关内容。
随着人类基因组测序计划的完成，生命科学的重心开始转移到对基因的功能性产物即蛋白质的研究，并产生了一门新的学科——蛋白质组学(proteomics) 。蛋白质组(proteome) ”一词是1995 年由澳大利亚科学家marc wilkins 和keith williams[1]最早提出的，是由蛋白质(protein) 和基因组(genome) 派生而来。被定义为“一个细胞或组织所表达的所有蛋白质产物或某一特定时期内所表达的所有蛋白质产物”。
蛋白质组研究与以往的蛋白质化学研究不同，它着重于全面性和整体性，研究的对象不是单一或少数的蛋白质，而是从细胞整体水平上对蛋白质的结构和功能进行研究，包括蛋白质在细胞内的表达水平、位置、功能和调节以及翻译后的修饰、剪接等加工信息。蛋白质组研究使人们对生命系统与活动分子机制的认识由间接的基因、核酸层次深入到生命的直接执行者——蛋白质水平。蛋白质组研究已成为后基因组时代的主要任务。
二、蛋白质组研究的主要技术。
相对于基因组的研究，蛋白质组的研究相对滞后，主要原因是缺乏像基因组研究那样成熟的技术。当前蛋白质组研究的主要技术可分为两大类，一类是蛋白质组的分离技术，包括双向电泳、双向高效柱层析等；另一类是蛋白质组的鉴定技术，包括质谱技术、生物信息技术等，其核心是质谱技术。由于，蛋白质的研究和发现是不断进步的，对于数据的储存处理是生物信息学成为蛋白质组的又一大研究技术。
1、蛋白质组的分离技术。
1.1双向凝胶电泳技术(2-de)
双向凝胶电泳技术是目前应用最为广泛的研究蛋白质组学的方法之一。双向凝胶电泳技术利用蛋白质的等电点和分子量差别将各种蛋白质区分开来。虽然二维凝胶电泳难以辨别低丰度蛋白，对操作要求也较高，但其通量高、分辨率高和重复性好以及可与质谱联用的特点，使其成为目前最流行、可靠的蛋白质组研究手段。
双向凝胶电泳技术及质谱基础的蛋白质组学研究程序为样品制备→等电聚焦→聚丙烯酰胺凝胶电泳→凝胶染色→挖取感兴趣的蛋白质点→胶内酶切→质谱分析确定肽指纹图谱或部分氨基酸序列→利用数据库确定蛋白。
根据第一项等电聚焦条件和方式的不同，可将双向电泳分为三种系统。第一种是在聚丙烯酰胺管中进行，载体两性电解质（carrier ampholyt）在外加电场的作用下形成梯度，这一系统被称为iso-dalt。它的最大缺点是不稳定，易发生阴极漂移。
第二种系统称为ipg-dalt，主要是采用丙烯酰胺和不同ph值的固定化电解质共聚所形成的具有ph梯度的ipg胶。第三种系统是非平衡ph梯度电泳，常常被用来分离碱性蛋白。
蛋白质组研究要求有高分辨率的蛋白质分离及准确、灵敏的质谱鉴定技术。凝胶电泳中蛋白质的着色不仅影响蛋白质分离的分辨率，同时也影响后续的质谱鉴定。蛋白质的染色可分为有机试剂染色、银染、荧光染色及同位素显色四类。
考马斯亮蓝染色法可用于胶上或膜上蛋白质点的显色，显色重现性好，容易操作，但灵敏度较低；银染法广泛用于双向凝胶电泳分离后蛋白质点的显色，灵敏度较考马斯亮蓝染色法高两个数量级，最低检测限可达0.1ng，但该法重现性较差，显色的浅性范围较窄；放射性检测方法灵敏度很高，但若不及时使用磷光成像分析技术，则耗时过长；使用荧光试剂染色相对来说灵敏度较高，线性范围宽，且可以实现不同蛋白表达样品在同一块凝胶板上进行显色，克服了方法重现性差的弱点，同时减少了对质谱鉴定的影响。
1.2差异凝胶电泳。
为改进双向电泳的重复性和灵敏度，最近发展了一种荧光染料标记的双向电泳技术(dige)，即差异凝胶电泳。传统的双向电泳胶间差异大，甚至难于区分系统误差还是样品间的表达差异，难以进行蛋白质差异研究。ettan dige荧光差异凝胶电泳技术在传统双向电泳技术的基础上结合了多重荧光分析的方法，可在同一块胶上同时分离多个分别由不同荧光标记的样品。
由于不同的荧光标记样品有不同的激发波长，可通过不同的滤光片记录互不干扰的胶图结果。由于有了多色荧光标记，使得在同一块胶中分离并分析多个样本成为可能。这样有效避免了不同胶间的系统误差，特别适合比较不同样本间差异。
1.3色谱分离技术。
色谱技术是利用各种物质在固定相和流动相之问不同的分配系数，使其在相对运动着的两相问经反复多次分配，以不同速度移动，从而获得分离的方法。按两相状态来分类，有气相色谱法(gas chromatography，gc)和液相色谱法(liquid chromatography，lc)两种，而其中的lc是蛋白质组学非凝胶蛋白分离技术中最常用的方法。单一的液相分离技术常不能满足复杂蛋白质复合物分离的需要，多维液相分离系统则在技术上弥补了单一的液相分离技术的不足。
多维液相分离系统是两种或两种以上具有不同分离原理特的液相分离方法的优化和组合，它有效地提高了系统对样本的分辨率和峰容量。此外，多维液相分离系统还具有快速、高通量、自动化、重复性好等优点[2]。常见的多维液相分离系统有二维液相色谱(two-dimensional liquid chromatography，2d-lc)、二维毛细管电泳(two-dimensional capillary electrophoresis，2d-ce)、液相色谱-毛细管电泳(lc-ce)等。
色谱技术除了直接对蛋白分离分析外，常与质谱技术联用。nielsen等应用lc-ms/ms技术成功分离和鉴定了海马组织中的1685种蛋白质[3]。
毛细管电泳(ce)作为一种最新的色谱分离技术，将经典电泳技术与现代微柱分离有机结合，目前已广泛应用于蛋白质的高效分离分析。与经典电泳相比，ce由于其侧面截面积大，散热快，能克服由于焦耳热引起的谱带展宽，且可承受高电压，因此分离效率提高，柱效可达几百万乃至几千万理论塔板数/m以上。ce在蛋白质组分析中用于蛋白质肽图的建立与蛋白质鉴定、物化常数分析、蛋白质动力学研究、样品定性定量检测与微量制备等方面。
ce在蛋白质组分析中用于蛋白质肽图的建立与蛋白质鉴定、物化常数分析、蛋白质。
1.4同位素包被亲和标记（icat）
icat是用同位素标记帮助蛋白质组定量研究的技术，基本原理是将某一状态的蛋白混合物标记后作为内标准， 与另一状态的蛋白混合物混合酶解，消化后的复杂多肽混合物通过亲和标签用生物素亲和层析柱将标记的多肽分离，最后分离的样品可以用lc-mc分析或用lc-mc/mc直接由蛋白序列信息来确定蛋白。这一技术克服了2dge的缺点，能全自动化，可以用于高通量蛋白质组"可以精确检测疏水的膜蛋白、pi和分子量偏大或偏小的蛋白，同时还能够测定其中蛋白质序列使它的分析范围远大于2deg[4]。有人用这一方法精确鉴定了体外和自然状态下分化的人hl60细胞微粒体片段中491个蛋白及其相对量，其中大部分是膜或膜相关蛋白。
icat在定量及差异表达检测上有巨大的优势，但也面临一些问题。icat最大的挑战在于样品高度复杂，质谱分析获得数据的能力与这种复杂性相比显得不足。但随着icat技术的不断进步与完善，它仍将是蛋白质组差异表达研究中的主要技术之一。
2、蛋白质组鉴定技术。
2.1质谱技术。
其原理是对2de所产生的上千个蛋白用传统的方法如edman降解法等进行分析将是一个很艰巨的任务。质谱技术的发展解决了这一难题。它需要三个步骤，首先通过离子化装置将分子转化为气态离子，接着通过质谱分析器按照质荷比（m/z）的不同进行分离，最后转化到离子检测装置[5]。
目前，用来分析蛋白质和肽的样品离子化技术主要包括基质辅助激光解吸收离子化质谱(maldi)和电子喷射离子化质谱(esi)。maldi通常与飞行时间质谱(tof)相结合。tof主要用来测量分析物飞过固定的路径所需的时间。
另一种鉴别蛋白质的方法是串联质谱(ms/ms)。在这种情况下，经质谱分析的肽段进一步断裂并再次进行质谱分析，这样可得到肽序列的部分信息。
质谱技术能清楚地鉴定蛋白质并能准确地测量肽和蛋白质的分子量、氨基酸序列及翻译后的修饰。目前ms/ms是唯一能够迅速测序n末端封闭或共价修饰肽段的方法。质谱技术很灵活，能与多种蛋白分离、捕获技术联用，对普通的缓冲液成分相对耐受[6]，能快速鉴定大量蛋白质点，而且很灵敏[7]，在一些情况下，仅需10-15 fmol的蛋白，这对鉴别蛋白是很有用的，特别是在只能得到极少量蛋白的情况下[7，8]。
在实际工作中可将几种技术结合应用，如串联质谱与edeman微测序技术相结合，maldi质谱与纳米电子喷射质谱相结合，这些技术相互互补，为分析2de所分离的大量蛋白质提供了有效的手段。
2.2表面等离子共振技术(spr)
spr是研究蛋白质相互作用的新技术，其原理是利用平面单色偏振光与金属膜内表面电子发生等离子共振时反射光强度最小时的入射角spr角[9]。与金属表面结合的生物分子的质量呈正比，如将“诱饵”蛋白作为配基，固化在几十纳米的金属膜表面加入“猎物”蛋白溶液，这样就可以通过spr角的改变来反映“诱饵”蛋白与“猎物”蛋白形成的蛋白质复合物，从而反映二者的相互作用。spr技术因其高效灵敏、无需额外标记等优势，广泛应用于蛋白检测和蛋白(蛋白相互作用等蛋白质组学研究，它能在保持蛋白质天然状态的情况下实时提供靶蛋白的细胞器分布、结合动力学及浓度变化等功能信息，为蛋白质组研究开辟了全新的模式。
细胞粗提液或上清液中存在未知配体，配体垂钓可以筛选并确定新配体。目前，此技术己广泛应于蛋白质组学、细胞信号传导、受体/配体、抗体/抗原分子垂钓、免疫识别、癌症研究和新药筛选等生命科学领域。
2.3串联亲和纯化（tap)
tap是由德国和法国的两家实验室开发出的一套研究蛋白质生理条件下相互作用的新方法。tap技术可以说是在研究蛋白质相互作用的方法学上获得了巨大的突破， 其基本原理是在目的蛋白的一端或中部导入蛋白质标记【主要由蛋白a的igg结合区(prota)和钙调蛋白结合区(cbp)构成，中间被一个tev蛋白酶的酶切位点隔开】。经过特异性的两步亲和纯化，在生理条件下与目标蛋白发生真实作用的蛋白质便可被洗脱下来，这样得到的蛋白质复合体接着可以用质谱技术或edman降解法进行鉴定。
该方法集成了经典的亲和纯化和免疫共沉淀这两种技术的优点，既吸收了经典亲和纯化可以得到高纯度、低拷贝数的蛋白质复合体，也继承了免疫共沉淀中运用特异性的标记蛋白与亲和柱之间的相互作用。可快速地得到生理条件下与目标蛋白存在真实相互作用的蛋白质。目前，tap技术与质谱技术的联用，以及质谱技术的自动化，使得大规模地分析相互作用的蛋白质在技术上已成为可能。
蛋白质的结构
蛋白质的二级结构。蛋白质二级结构 secondary structure of protein 指它的多肽链中有规则重复的构象，限于主链原子的局部空间排列，不包括与肽链其他区段的相互关系及侧链构象。二级结构主要有 螺旋 折叠 转角。常见的二级结构有 螺旋和 折叠。二级结构是通过骨架上的羰基和酰胺基团...
蛋白质化学作业
蛋白质化学。要掌握的知识点 氨基酸的结构和分类。蛋白质的分子结构。蛋白质结构和功能的关系。蛋白质的主要理化性质。蛋白质提纯分离的一般方法。作业 一 名词解释 等电点 蛋白质或两性电解质 如氨基酸 所带净电荷为零时溶液的ph。盐析和盐溶 盐析一般是指溶液中加入无机盐类而使溶解的物质析出的过程 盐溶是在...
《蛋白质化学大作业》
试设计一种新型食品加工用酶的制备和分离纯化过程 蛋白质食品高。值化加工技术及过程或者发酵食品加工过程，操作条件以及检测方法，并对其合理性加以论证。要求 1 用多 演讲1.小时 2 交一份文字作业 word文档 3 各附三篇中外文参考文献。1 论述蛋白质原材料 如 胶原蛋白 乳蛋白 卵类蛋白 大豆蛋白...