实验一猪血中超氧化物歧化酶（sod）的分离纯化及活力测定。
一、原理。超氧化物歧化酶(superoxide orgoteindismutase，sod)是一种能专一地清除超氧离子自由基（o2-）的金属酶，他具有抗衰老、抗辐射、抗炎和抗癌等作用，因而在医药、化妆品、食品工业等方面具有了广泛地应用前景。
sod是一种酸性蛋白，对热、ph和蛋白酶的水解较一般酶稳定。按照它所含金属离子的不同，可分为cu---zn---sod、mn---sod、fe---sod等三种。
cu---zn---sod为二聚体，呈蓝绿色；mn---sod呈紫红色；fe---sod呈褐色。
sod催化下述反应：2h++2o2-→h2o2+o2。机体内o2-的过量和不足均对机体不利，sod对过量的o2-的及时清理保证了机体内o2-的含量相对平衡。
机体内的o2-的形成可分为病理性和生理性两方面。在一些正常的生理过程中会形成一些o2-。例如：
呼吸链中电子传递结果可产生一些o2-。在某些疾病（如氩中毒、辐射病等）过程中产生大量的o2-，如不及时清理，会对细胞损伤。sod将o2-歧化为h2o2，而过氧化氢（物）酶、谷胱甘肽过氧化酶可以催化过氧化氢分解，在机体内形成一套解毒系统，对机体起防护作用。
本实验采用有机溶剂沉淀法以新鲜猪血为原料，从中提取sod并进行纯化。酶活力测定可用以下方法：邻苯三分自氧化法、黄嘌呤氧化酶法、nbt光还原法、化学发光法、肾上腺自氧化法、亚硝酸法等。
该实验sod酶活性采用邻苯三分自氧化法测定，酶活性单位定义为：每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三分自氧化速率达50%的酶含量定义为一个酶单位。
样品中蛋白质含量用考马斯亮蓝g-250法测定。考马斯蓝g-250（coomassic brilliant blue g-250）在游离状态下呈紫红色，与蛋白质结合呈现蓝色。在一定范围内，溶液在595nm波长下的光密度与蛋白质含量成正比，可用比色法测定，测定范围1-1000ug。
二、实验试剂与器材。
试剂]1 sod的提取。
acd抗凝剂：柠檬酸10g，柠檬酸钠30g，葡萄糖25g，用适量蒸馏水溶解并稀释至1000ml.
0.9%nacl：称取0.9g，溶于100ml蒸馏水中。
丙酮。95%乙醇。
氯仿。2sod活力测定。
50mmol/l ph8.3磷酸缓冲液。
10mmol/l edta钠盐溶液。
3mmol/l 邻苯三酚溶液（用10mmol/l盐酸配制）
3考马斯亮蓝g-250法测蛋白质。
考马斯亮蓝g-250试剂：称取100mg考马斯亮蓝g-250，溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%（w/v）的磷酸，蒸馏水定容至1000ml。此试剂常温下可保存30天。
标准蛋白质溶液：精确称取结晶牛血清白蛋白25mg，加蒸馏水溶解并定容至100ml。吸取上述溶液40ml，用蒸馏水稀释至100ml，即为100ug/ml的标准蛋白质溶液。
器材]752分光光度计；分析天平；具塞试管；刻度吸管；（1ml，5ml）；离心机；烧杯（50ml）。
三、操作步骤。
1 sod的提取。
1.1 取新鲜猪血20ml（预先按0.15:
1（v/v）的比例加入acd抗凝剂），4000r/m，10min，去上层血浆，取下层红血球粘稠液，并量其体积，然后加入2倍体积的0.9%nacl溶液清洗，4000r/m，10min，弃上层清液，再加入2倍体积的0.9%nacl溶液重复清洗一次，4000r/m，10min,得洗净的红血球浓稠液（7.
5ml）。
1.2 向洗净的红血球中加入等体积的蒸馏水，剧烈搅拌30min，使其充分溶血。再向溶血液中缓慢加入预冷的0.
25倍体积的95%乙醇溶液（3.75ml）和0.15倍体积的氯仿（2.
25ml），匀浆呈暗红色，再继续搅拌15min，4000r/m，10min，去变性蛋白沉淀物，得上层液（记体积v1：7.25ml），留样1ml。
将上层液用多。
层纱布进行粗滤，以除去上层液中的漂浮物，然后将清夜在65-70℃恒温水浴中进行热处理，15min后取出迅速冷却至室温，4000r/m，5min除沉淀，得浅黄色粗酶液（记体积v2：5.65ml），留样1ml。
1.3 向粗酶液中加入等体积的丙酮溶液，冰箱（-20℃）中静置1h，4000r/m，10min弃上清液，得沉淀。将沉淀物用等体积预冷的丙酮溶液洗2次，离心收集沉淀，自然干燥即得淡绿色成品，按1mg/ml溶于蒸馏水，备用。
（本实验加入3ml蒸馏水进行溶解，记体积v3：3ml）
2sod活力测定。
2.1 邻苯三酚自氧化率的测定。
取4.5ml 50mmol/l ph8.3的磷酸缓冲液，4.
2ml蒸馏水和1ml10mol/ledta-na2溶液，混匀后在25℃水浴保温20min，取出后立即加入25℃预热过的邻苯三酚溶液0.3ml，迅速摇匀，倒入光径1cm的比色杯内，用10mmol/l hci作空白，325nm波长下每隔30秒测光密度值一次，整个操作在4min内完成，计算出每分钟a325的增值，此即为邻苯三酚自氧化率。要求自氧化率控制在0.
070/min左右。
2.2 酶活力测定。
操作与[1]一致，加入邻苯三酚前，先分别加入50μl、40μl、20μl的sod样液，蒸馏水则减少相应的体积，同理测其光密度值，计算加酸后邻苯三酚自氧化率。
2.3 酶活性单位的计算。
根据酶活性单位的定义，按下列公式计算酶活性：
a0-am)/a0*100样液稀释倍数。
单位活性（u/ml）=*反应液总体积数*
50样液体积。
其中，a0为邻苯三酚自氧化率；am为加酶后邻苯三酚自氧化率。
总活性（u）=单位活性*酶原液总体积。
3 蛋白质含量测定（考马斯亮蓝g-250法）
3.1 标准曲线的制作：取6支具塞试管，编号，按下表加入试剂：
塞上盖子，摇匀。注意各管振荡程度尽量一致。在595nm波长下比色测定光密度值，比色应在1h内完成。以牛血清蛋白质含量（ug）为横坐标，光密度值为纵坐标，绘出标注曲线。
3.2 样品中蛋白质含量的测定。
将待测的sod溶解并解释到一定浓度，取1支具塞试管，准确加入50μl、200μl、100μl样品提取液，加入相应蒸馏水0.975ml、0.8ml、0.
9ml和5ml考马斯亮蓝g-250试剂，其余操作与标准曲线制作相同。
3.3 蛋白质含量计算。
根据所测样品提取液的光密度，在标准曲线上查到相应的蛋白质含量，计算其浓度。
3.4 结果处理。
利用考马斯亮蓝g-250法测定每毫升酶原液蛋白质毫克数。
单位活力（u/ml）总活力。
比活力（u/mg）=
单位蛋白质浓度（mg/ml）总蛋白质（mg）
四、实验结果。
1 测定邻苯三酚自氧化率。
表1加酶前邻苯三酚溶液光密度值。
计算得邻苯三酚自氧化率a0=0.074/min
2 测定加酶后邻苯三酚自氧化率。
表2加酶后邻苯三酚溶液光密度值。
注：样1、样2、样3分别表示除血蛋白血清、热变性后上清、丙酮沉淀后的样品，下同）
计算得各样品溶液中邻苯三酚自氧化率分别为：
a1=0.032/mina2=0.036/mina3=0.50/min
3 酶活性单位的计算（单位活性、总活性）
表3各样品酶活性单位计算值。
4 蛋白质含量测定。
4.1 制作标准曲线。
表4标准蛋白液的595nm处的光密度值。
根据上表绘制标准曲线，如下图：
4.2 蛋白质含量计算。
通过公式y = 0.006x + 0.0389计算样品中蛋白质含量，如下表：
表5各样品中蛋白质含量。
5 综上可得本次试验结果总表，如下：
表6实验结果汇总。
五、分析讨论。
1、本实验纯化过程中，蛋白质含量、酶总活性逐渐降低，酶活性、比活性逐渐增加，表明纯化倍数逐渐增大，实验基本成功。
2、本实验中，丙酮沉淀后的酶**率较低，说明实验操作过程还需注意，应争取通过严谨的实验操作以提高酶**率。
3、本实验中蛋白质标准曲线r2=0.9719，表明用所得函数计算出的样品蛋白质含量较可靠；操作中应重复测量光密度值，用平均值作图，以期得出更为准确的数学函数；样品1中的蛋白质含量偏高，表明在提取sod第一步中蛋白质未充分分离沉淀，导致含量偏高，实验操作时需要注意。
4、实验中由于需要留样，导致酶的**率比实际值偏低，操作时应注意保证溶液的绝对量或计算时用矫正公式计算，以减少或消除因留样而产生的误差；在进行剧烈搅拌时，调节好置放装置位置和转速，以免溶液溅出，降低**率。
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