专业英语课程**。
题目：大豆胞囊线虫胞囊上生防。
真菌的分离、鉴定和分布。
导师：李洪连教授。
方向：小麦胞囊线虫的生物防治。
姓名：张飞跃。
班级：2006级研究生。
2023年12月20日。
大豆胞囊线虫胞囊上的生防真菌的分离、
鉴定和分布。
d. g. kim, r. d. riggs, and j. c. correll
阿肯色州立大学植物病理学系费耶特威尔 72701）
摘要在1992和2023年间，从美国沿密西西比河和密苏里河的10个州的33个县收集到76种大豆胞囊线虫。在肯塔基州、路易斯安那州、密西西比州和田纳西州的10种胞囊线虫的卵和胞囊上分离到一种未被命名分类、指定为arf18、并且是大豆胞囊线虫卵的寄生菌的不育丝孢真菌。根据它们在几种培养基上的栽培形态、在玉米粉琼脂培养基上产拟菌核结构(sls)的能力、生长速度以及离体条件下对大豆胞囊线虫卵的致病力、mtdna的rflps检测，对这次研究中获得的arf18的10个菌株和以前研究中获得的7个菌株进行了鉴定。
所有这17个arf18菌株在pda、玉米琼脂和营养琼脂培养基上都很容易生长，基于玉米琼脂培养基上的群体形态和sls的外观，这些菌株都可以归类到两种形态类型：组成sls结构的菌丝致密的菌株为arf18-c，而形成sls结构的菌丝疏松的菌株为arf18-l。这两种菌株只在生长速度上有微小的差别。
从阿肯色州、路易斯安那州、密西西比州和田纳西州分离到的10个arf18-c菌株都属于一个独立的mtdna rflp单体；而那7个arf18-l菌株和另外一个都呈现出很多的mtdna限制性片段条带，都属于三个不同的mtdna rflp单体。arf18的不同菌株在离体条件下对大豆胞囊线虫卵的感染能力有明显差别。准确地说，arf18-c的一些菌株能够感染大豆胞囊线虫50%（平均值=70.
0%, 标准差= 16%）以上的卵；而arf18-l菌株对卵的感染能力则较小（平均值= 25%, 标准差= 27%）。arf18-c菌株仅能从北纬37度以下的地区分离到。arf18菌的存在与下列因素有关：
土壤中mg<314 kg/ha、胞囊数》4.5/100 cm 3、并且铁》203.5 kg/ha；或者mg >314 kg/ha、na <121 kg/ha。
arf18菌的广泛分布和它的一些菌株对大豆胞囊线虫卵的侵染能力都表明：arf18菌作为大豆胞囊线虫的生物防治因子具有潜力。
关键词种；土壤因子；大豆胞囊线虫。
大豆胞囊线虫scn（heterodera glycines ichinohe）起初是在2023年从密西西比河流域的田纳西州和密苏里州发现的，随后在其他一些大豆产区也被发现。2023年，大豆胞囊线虫在沿密西西比河和密苏里河的11个州的500多个县流行。因为化学农药对控制线虫的有用性和危险性受到关注，从而提高了人们对选择生物防治或化学防治策略的兴趣。
2023年，在阿肯色州线虫种群衰退的土壤中分离到一种未被命名的、指定为arf18的不产孢丝核菌，并表明可以作为大豆胞囊线虫的生防菌。arf18是一种独特的病原线虫生防真菌，它能直接穿透胞囊壁进入胞囊并杀死卵。直接穿透对于抑制胞囊线虫具有特别的意义，因为胞囊壁是保护卵的屏障。
虽然2023年在阿肯色州分离到arf18，但它在其他州的分布和分类学还不清楚。arf18很难形成孢子并且很少有用来鉴别的特性可供利用。在玉米琼脂培养基（cma）上，arf18的栽培和形态学特性包括清晰、有隔的带有伏罗宁小体的菌丝(宽4.
0 μm)和sls结构，或多或少紧密填满与丝状菌丝有明显差别的细胞(fig. 1)。dna的rflps越来越多地用于真菌的鉴定，这些技术对于鉴定未知的和不确定分类的真菌很有利。
这项研究的目的就是为了确定寄生大豆胞囊线虫的arf18在中美地区的地理分布，鉴别它的生长特性、不同培养基上的栽培特性、致病性、(mt) dna 的rflps，以及对分离到arf18的田块的土壤特性的分析等。
材料与方法。
土壤取样和线虫提取土壤样品是在2023年秋季和2023年间，在美国中部地区从路易斯安那州到明尼苏达州的大豆田中获取的(fig. 2)，而这些田块是通过运用便携式胞囊提取器确定有大豆胞囊线虫危害的田块。要确定arf18存在与否，是在清除掉上层的植物残骸后收集15cm深的土壤大约5千克。
土壤样品放进塑料袋中，在4°c条件下处理1个月时间，每个土壤样品分成4份：1千克土用于通过过筛和离心浮选法来确定土壤中大豆胞囊线虫卵的数量；100克土送往阿肯色州土壤测试实验室（费耶特威尔的阿肯色州立大学）用于化学分析；200克土在费耶特威尔的阿肯色州立大学的土壤测试实验室用来做粒度分析；剩余土壤样品用来做胞囊寄生真菌的分离。
每一种线虫的亚种都通过把它接种到易感所有大豆胞囊线虫的三株大豆栽培种lee 74上，并且每一个不同的亚种pickett，peking，pi 88788和pi 90763都分别接种三株，栽培在发病（大豆胞囊线虫）土壤上来确定线虫的亚种。30天后，对胞囊和雌虫进行检查并计数。亚种的确定是根据线虫在lee 74的不同栽培种上所形成的胞囊和雌虫的数目而定。
arf18的分离从收集的76种线虫的土壤样品中分离大豆胞囊线虫的胞囊。从每个大豆胞囊线虫种群里挑选约30个胞囊用于分离arf18。这些从大田土壤中收集来的胞囊都专门放在不良条件下，即卵量少、能生长一些腐生真菌。
由于从田土中直接获得的胞囊上分离到很少的寄生菌，所以后来改用从温室土壤中分离。把从每个地方采集的约250 cm3的土壤装入直径15 cm的瓦盆中，并放进温室内，每盆种两株lee 74苗。2～4个月后，用过筛法和离心漂浮法提取雌虫和胞囊，每盆中分拣出30个胞囊。
所分离到的被arf18所侵染的胞囊，变为黑色或粉红色，胞囊上长有菌丝体；或者比正常胞囊小，并且菌丝块呈淡黄或者浅灰色。
为从卵上分离到真菌，把胞囊表面用0.5% naocl消毒10 min，并用无菌水清洗，然后挑破胞囊壳释放出卵。卵表面用0.
5%naocl消毒5 min，用无菌水冲洗两次，然后放在1.5%的水琼脂培养基上，再放在21±2℃条件下孵化7天，并每天检查。把卵上生长的真菌转到cma培养基上进行纯化培养。
arf18的生长特性与形态学为测定arf18的生长速度，把分离到的供试菌株从生长良好的菌落上切取直径4毫米的小块，转接到装有pda(difco laboratories, detroit)、cma(difco laboratories)或者营养琼脂培养基na(difco laboratories)的彼得里平皿（100×15mm）上，放在黑暗处22±2℃下培养，每三天对菌落进行测量一次，并在彼得里平皿的边缘做标记，共观察测量18天。随机完全区组设计，三次重复，并进行一次重复试验。cma上sls的数目在一个周期要观察90天，对菌株的鉴定还包括菌落直径的测量和产生菌落的数量。
arf18菌株的致病性大豆胞囊线虫卵寄生真菌的致病性是通过每一种分离物在pda、cma和na上的生长情况来确定的。把从每一个培养基上切取下的生长良好的直径4mm的菌块，转接到装有1.5%水琼脂培养基的60×15mm的彼得里平皿里。
把3种大豆胞囊线虫每种取5个大小和颜色相近、新鲜饱满的胞囊进行表面消毒，并直接放在所切取的菌块的上面。培养皿为防止干燥可放进塑料袋中，放在22±2℃黑暗条件下培养10天。这两组培养皿按每种分离物、每种培养基进行随机完全区组设计试验，每种分离物、每种培养基20个胞囊一块进行重复试验。
每种分离物每种培养基按10个胞囊一起放在1.5%水琼脂切块上。这项研究所用的每个胞囊应含有大约350个卵和一些二令线虫。
10天后，收集菌落上的胞囊并放在载玻片上，再滴一滴乳化甘油（乳酸85%，甘油99.5%和蒸馏水，容积比为2：2：
1）并挤破胞囊释放出卵。有无寄生症状的卵壳对着色剂的渗透性的差别使检测被寄生的卵便利了。有寄生症状的卵很快就变得清亮（1分钟内），而无症状的卵则在超过5分钟的时间内也保持不变。
很显然，乳化甘油能够迅速渗透被感染的卵壳，但并不是所有的有症状的卵都被感染。死亡的卵在乳酚酸中也象有症状的卵一样显得清亮。对这些有无症状的卵和幼虫都在30倍立体显微镜下记数。
卵的寄生率按照所有卵和幼虫的总数计算。
mtdna rflp分析对17种分离物进行了mtdna rflps检测。其中被检测的10种分离物作为这项研究的一部分，另外7种则收入以前的研究中。菌丝体是在豌豆汁液体培养基（罐装甜豌豆汁：
水=1：3）**条件下培养10天，温度为22± 2°c，自然光照。每个分离物的菌丝体的全部dna都是通过一个简易程序提取出来的，即把冻干的菌丝体放进液氮中，用氯仿和苯酚萃取，再使其沉淀并溶解到缓冲剂中。
根据制造商的推荐，全部dna用三种限制性内切酶haeiii, ecori, 或者 mspi（new england biolabs, inc., beverly, ma）中的一种进行剪切，并在0.5×tris-borate-edta缓冲剂中，在0.
7%的琼脂糖凝胶上对dn**段进行电泳分离。使用从炭疽病上获得的两个mtdna克隆2μ18 和4μ40探测到了斑点，使用一个增强的化学发光dna试剂盒(ecl; amersham corp., arlington height, il)来标记mtdna克隆。
这些分离物都通过可视化检测mtdna rflp样本来确定一个mtdna 单倍体。
土壤分析有或没有arf18的土壤样本，都通过化学和物理因子的比对来确定含有arf18的土壤因子的关系。为确定土壤因子对真菌存在的关系，应用logistic回归分析对所有76个样本或者仅对从北纬37°以南地区收集的48个样本进行分析，通过最大相似法对分类变量进行sas proc logistic分析，很显然地符合线性logistic回归模型，类似的实验也成功地对土壤真菌类群进行了研究。最后，分类树程序也用来作为一个额外的关系分析检验。
这个程序的应用所产生的分类树，标明了选择化学和物理土壤样本的检测方法的具体的特性和水准，可以用于**土壤检测样本中arf18的存在与否。
结论。线虫的获得大豆胞囊线虫全部来自沿密西西比河和密苏里河(fig. 2)的10个州的33个县区收集的76种土壤样本。
来自伊利诺斯（il）、爱荷华（ia）、堪萨斯（ks）、明尼苏达（mn）、密苏里（mo）或内布拉斯加（ne）州的每一个大豆胞囊线虫种群都分属于种族3或者种族1，但多数是种族3。从南部各州肯塔基（ky）、路易斯安那（la）、密西西比（ms）和田纳西（tn）州收集到的种群分为种族2，3，4，5，6，7或14，但仅有一个种群是种族3。
从胞囊上分离arf18 把进行了表面消毒的卵放在水琼脂培养基上，5天之内，类似arf18的真菌就从被感染的卵上生长出来。arf18可以从76种大豆胞囊线虫中的10种上分离到(table 1, fig. 2)，这10种胞囊线虫鉴定为种族5（tn（ky或ms（la或ms）或者14（ms）。
然而，每种线虫的3000多卵放在水琼脂培养基上，arf18仅从10种线虫每一种的不到50个卵上长出来。分离到arf18的所有地区都在北纬37°以南(fig. 2)。
在分离过程中从卵上分离到的其他许多真菌都被认为是一些普通的腐生菌。
arf18的生长特性与形态学这次研究所获得的arf18的10种分离物和以前所获得的7种分离物，在pda、cma和na上都生长良好，但在不同培养基上也观察到有些微小的差别（p = 0.01）。在cma上生长速度最快（18天后从直径3.
0 cm长到3.5 cm），其次是pda和na。
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