酸奶对小鼠肠道微生物活性和免疫功能的影响。
关键词： 酸奶肠道微生物免疫功能疲劳指数胸腺指数脾脏指数。
酸奶是以新鲜牛乳为原料，添加适量的糖，经过巴氏灭菌和冷却后加入乳酸菌制剂，在适宜的条件下进行发酵的乳制品。在注重健康和养生保健的今天，酸奶制品越来越受到人们的青睐，酸奶不但含有人体生长发育所需的蛋白质、维生素和微量元素，而且还具有整肠作用、抗菌作用、调整胃肠功能、降低胆固醇、抗癌等保健功能。已有研究表明酸奶有益于人体健康，包括改善胃肠道功能，调节肠道正常菌群以及对人体免疫系统具有显著的促进作用[1][2]。
酸奶是我国的主要乳制品， 我国消费量比较大，在20年来的研究中发现，乳酸菌在体液免疫和细胞免疫中发挥着调节作用[3]，使酸奶在国内外掀起一阵阵热潮，接连受到大家的追捧。研究表明乳酸菌和酸奶具有免疫增强作用是由于酸奶引起胃肠道微生物发生改变[4]，肠道中乳酸菌的增加可抑制其它病菌的生长繁殖[5][6]。此外通过酸奶人体研究表明饮用酸奶使细胞因子产量和抗体产量增加[7][8][9]，吞噬活性[10]、t细胞功能[11]和自然杀伤细胞活性增强[12]。
近几年，在国外曾有些报道是对酸奶生理功能的研究，但在国内很少有这方面的研究报道，特别是酸奶对肠道微生物活性和免疫功能的影响，尚未有研究报道，所以进行这方面的研究，不但对消费者合理地储存和消费酸奶提供理论依据，而且对促进我国乳品工业的发展及人类健康都有一定的现实意义。
1 材料方法。
1.1 材料：某品牌市售酸奶（含活性乳酸菌）、emb和mrs固体培养基、健康小鼠5只、结晶紫染液。
1.2 仪器：各小组根据实际情况，结合试验步聚，自行收集和准备，但共用仪器（如温箱、pcr仪等）设备除外。
1.3方法。
1．3．1 小鼠模型建立：用实验准备酸奶饲喂小鼠，任其自由采食，连续饲喂六天，每天观察小鼠临床状态，并做好记录。
1．3．2 小鼠称重：试验组和对照组小鼠每天均需要称重1次，并做好详细记录。称重一直持续至前处理试验结束为止。
1．3．3 小鼠疲劳指数检测：在实验前进行小鼠疲劳指数测定，将小鼠置于装有清水的桶中，让其自由在水中游泳，观察其状态，记录小鼠溺水时间。
1．3．4 免疫器官指数测定：对取过腹水的小鼠进行无菌解剖。剥离胸腺、脾脏和肠道至无菌离心管中，称重，计算免疫器官指数。
免疫器官指数=免疫器官重（g）/ 小鼠体重（kg）
1．3．5白细胞功能测定： 取离心管1支，加肝素20μl，加外周血100μl，混匀。
加入过滤墨汁10μl，混匀，加塞。置37℃温育4h。取温育后样本，推制成血涂片，干燥后，用甲醛固定，待细胞变白后，经结晶紫或美兰染色，用油镜观察。
油镜下观察计数幼稚细胞或中性成熟粒细胞100个；计数单核细胞20个。
判断结果】根据细胞吞噬墨粒多少及大小，可定为下列程度：
阴性：细胞内未见吞噬墨粒。
阳性：(+细胞内吞噬有小墨粒1～5个。
细胞内吞噬有大小不等墨粒10个左右。
+++细胞内吞噬有大墨粒10个左右，小墨粒较多。
(++细胞内吞噬有多数大颗墨粒，并有块状、球状，小墨粒很多，但细胞核清楚。
计算吞噬率及吞噬指数。
注意事项】肝素剂量对白细胞的吞噬功能有影响，肝素用量过大，细胞形态异常，吞噬率和吞噬指数降低；肝素用量过小，影响抗凝。以每100μl血用0.3u肝素为最适宜。
参考范围】成熟中性粒细胞吞噬率59～89%，吞噬指数66～186
成熟单核细胞吞噬率90～100%，吞噬指数227～399。
1．3．6 肠道微生物（大肠杆菌与乳酸杆菌）菌群测定：小鼠肠道内容物采集：无菌将小鼠肠道剖开，取肠内容物若干，并用无菌生理盐水反复冲洗肠道，洗液最终全部与内容物放入离心管中（注意生理盐水使用剂量不宜过大）。
5000rpm，离心5分钟。肠道微生物菌数测定：取内容物上清液100ul进行10倍系列稀释。
选取和107稀释度菌液50ul，用l棒分别涂布于emb和mrs固体培养基中。请预先将平板分隔成三个区域并做好标记。emb平板可直接置于温箱中，37℃培养。
而mrs平板需要先放置密封罐中（在罐中点燃蜡烛，待熄灭后，密封），然后置于温箱中，37℃培养，计数。
2 实验结果。
2．1 通过实验模型的建立，小鼠自由采食酸奶后，体重没有明显变化，每天测量小鼠体重如下图所示，将实验鼠与对照鼠比较后，差异不显著，小鼠体重曲线呈波动型。对于出现的体重波动可能是天气原因以及酸奶的适口性所造成的差异。所以从本实验来看酸奶对小鼠的体重没有太大影响。
小鼠体重变化情况曲线。
2．3 通过免疫器官指数测定，将小鼠分别解剖后，准确称量小鼠的脾脏和胸腺重量，根据其平均体重，分别计算各小鼠的胸腺指数和脾脏指数如下图所示。
小鼠胸腺指数与脾脏指数。
2．4 白细胞功能测定结果，通过镜检观察小鼠的血涂片，观察吞噬细胞吞噬墨粒的大小及多少。
1号鼠2号鼠3号鼠。
4号鼠5号鼠。
2．5 通过37℃恒温培养24h后，在emb和mrs固体培养基中，只有1号鼠和3号鼠的emb培养基生长出细菌菌落，其它培养基均未出现任何细菌生长，随即取生长的菌落进行格兰仕染色，油镜下观察到红色小杆菌，证实了emb培养基上生长的菌落为大肠杆菌菌落。
1号鼠emb培养基细菌生长情况3号鼠emb培养基细菌生长情况。
1号鼠细菌格兰仕染色情况3号鼠细菌格兰仕染色情况。
3 讨论。有动物实验表明酸奶中的微生物有耐胃酸及肠消化液作用，进入人体肠道后，通过其生长及各种代谢作用促进肠内细菌丛的正常化，抑制肠内腐败物质的产生，抑制有害菌生长。酸奶中的微生物可分为两类：
发酵用乳酸菌和生物活性用乳酸菌(益生菌),前者决定酸奶风味、口感，后者决定其营养价值，但在牛奶中发育缓慢，且影响口感目前酸奶发酵广泛使用两种乳酸菌是保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌。本实验中，所用的酸奶是以乳酸杆菌为只要菌种发酵而成，但是通过小鼠的肠道细菌分离结果来看，在msr培养基上并没有生长任何菌落，分析原因有可能是在l棒涂布时灼烧温度过高，造成乳酸菌大量死亡以及乳酸菌属于兼性厌氧菌，在培养基培养时没有创造无氧条件，使乳酸菌没有有利的生长条件。在emb培养基上只有103稀释度下有菌落生长，其它均没有，有可能是稀释度过大造成。
另一方面，在实验结果中，白细胞功能测定时镜下观察吞噬墨粒细胞及少，有的甚至观察不到，通过分析讨论得出造成这种结果的原因是在小鼠取血时，没有取到心脏血，本次实验所取得血液基本为胸腔血，而胸腔血液中的白细胞非常少。由于心脏取血不好掌握，因此建议在取用心脏血时最好将心脏剪下置于装有肝素的离心管中，在离心管中将心脏剪碎，使血液流出。
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