一、microrna简介。
1．什么是microrna
micrornas（micrornas）是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码rna，其大小长约19~23个核苷酸。成熟的micrornas是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，随后组装进rna诱导的沉默复合体，通过碱基互补配对的方式识别靶mrna，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mrna或者阻遏靶mrna的翻译。最近的研究表明microrna参与各种各样的调节途径，包括生物个体发育、病毒防御、组织分化、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢、参与原癌基因作用等等。
2. microrna的发现。
2023年，lee，feinbaum和ambros等人发现**虫体内存在一种rna（lin-4），是一种不编码蛋白但可以生成一对小的rna转录本，每一个转录本能在翻译水平通过抑制一种核蛋白lin-14的表达而调节了线虫的幼虫发育进程。对于出现这种现象的原因，科学家们猜测是由于基因lin-14的mrna的3'utr区独特的重复序列和lin-4之间有部分的序列互补造成的。在第一幼虫阶段的末期降低lin-14的表达将启动发育进程进入第二幼虫阶段。
7年后科学家又发现了第二个microrna－let-7，let-7相似于lin-4，同样可以调节线虫的发育进程。
自从let-7发现以来，应用随机克隆和测序、生物信息学**的方式，又分别在众多生物体如病毒、家蚕和灵长类动物中发现了上千个的micrornas。被鉴定的micrornas均被mirbase**整理并加以注释。此**由著名的sanger研究所主办，并对公众开放。
（3. microrna的产生与作用机制。
microrna基因以单拷贝、多拷贝或基因簇等多种形式存在于基因组中，约60%microrna单独表达，15%的microrna一基因簇的形式表达，而25%的microrna位于基因的内含子中，与基因同时被转录。
microrna通常**于一个大小约1000bp的长链rna初始转录产物（pri-microrna），pri-microrna分子在细胞核中经过双链rna特记性rnaseiii-drosha的作用形成70-100nt的具有茎环结构的rna分子（pre-microrna）。pre-microrna在exportin-5的作用下转运至细胞质中，被另一个双链rna特异性rnaseiii-dicer识别，被进一步切割成19-23nt的小分子rna，即成熟的microrna，microrna再被ppd（paz&piwidomain）蛋白质家族成员识别并结合，类似rna干扰过程形成rna/蛋白质复合体—risc（见下图）。在动物细胞中，单线microrna通过序列完全或不完全的匹配互补到mrna上，从而抑制mrna的翻译。
但是microrna抑制mrna翻译的机理还不清楚，目前发现的机理有：minra翻译起始抑制机制；microrna翻译起始后抑制；microrna介导的mrna衰减；microrna的正调控和去抑制等等，具体机理还有待我们科研工作者进一步研究和**。
4. microrna与sirna的异同。
sirna是rnai途径的主要作用物，microrna和sirna很容易混淆，他们有许多共同点也有许多不同点。
microrna和sirna都是由22个左右的核苷酸组成，都依赖dicer酶的加工，是dicer的产物，所以具有dicer产物的特点。二者生成都需要argonaute家族蛋白存在，而且都是risc组分，所以其功能界限变得不清晰，如在介导沉默机制上有重叠。另外，它们都可以在转录后和翻译水平干扰以抑制靶标基因的翻译。
microrna和sirna本质上的区别就是microrna是内源的，在基因组中有固定的基因座位，70％～90％位于蛋白基因的基因间隔区，其余在内含子，还有个别在编码区的互补链；sirna可以是人工体外合成的，也可以是基因组的转录片断，降解片断，和转座片断，病毒基因组转录片断等，关键在于sirna没有固定的基因座位，本身不是基因组的功能片断，是随机产生的，即加工位点不是保守的。结构上，microrna是单链rna，而sirna是双链rna。酶对二者的加工过程不同，microrna是不对称加工，microrna仅是剪切pre-microrna的一个侧臂，其他部分降解；而sirna对称地**于双链rna的前体的两侧臂。
在作用位置与作用方式上，microrna主要作用于靶标基因3′-utr区，可抑制靶标基因的翻译，也可以导致靶标基因降解，即在转录水平后和翻译水平起作用，主要在发育过程中起作用，调节内源基因表达。而sirna可作用于mrna的任何部位，但sirna只能导致靶标基因的降解，即为转录水平后调控，原始作用是抑制转座子活性和病毒感染。
二、microrna的研究思路与方法。
对microrna的深入研究具有重大的生物学意义，不仅有利于我们对生物体生理、病理机制的理解，还能为疾病的诊断和**中提供理论依据。
已有研究表明，microrna在发育、细胞增殖、凋亡、脂类代谢、激素分泌及肿瘤发生等多种生理和病理过程中发挥重要作用。针对microrna的研究方法主要包括两大类：一是以传统实验技术方法为基础建立起来的microrna特有的技术方法，二是已成熟应用的生物信息学技术。
前者侧重于microrna表达的检测和功能机制的阐明，后者则包括新microrna基因及microrna靶基因的**。两者相辅相成，互为补充，为深入地研究这类分子的功能和分子机制提供了大量功能线索及确凿的实验证据。
由于microrna序列短、没有poly(a)尾巴、在细胞内的表达水平比较低，而且许多同源microrna（如let-7家族）序列相似度高，仅差1-2个碱基，使设计的分析探针与杂交的效率低。这些特性给microrna定量检测方法的建立带来了困难和挑战。
为了提高杂交反应的亲合性和检测灵敏度，丹麦exiqon公司的锁核酸（locked nucleic acid， lna）技术被应用于microrna的分析研究。lna是一种双环结构的核酸类似物，这种特殊的双环状核苷酸衍生物结构中含有一个或多个2’-o，4’-c-亚甲基-β-d-呋喃核糖核酸单体，核糖的2’-o位和4’-c位通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，并连接成环形，这个环形桥锁定了呋喃糖c3’-内型的n构型，降低了核糖结构的柔韧性，增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性，实验表明，在寡核苷酸探针中每引入1个lna修饰碱基，其与相应的dna杂交时，解链温度会提高1-8℃，而在与rna杂交时解链温度会提高2-10℃，从而提高lna探针与microrna分子的杂交特异性和灵敏度。
由于lna与rna在结构上具有相同的磷酸盐骨架，故其对rna有很好的识别能力和强大的亲和力。与其他寡核苷酸类似物相比，lna有很多优点：和rna互补的双链有很强的热稳定性、实现探针高灵敏度；水溶性好，自由穿入细胞膜，易被机体吸收；体内无毒性作用；高效的自动寡聚化作用，合成方法相对简单，部分或完全修饰的lna寡核酸链可用氨基磷酸法在dna自动合成仪上合成。
lna探针与核酸杂交具有严格序列特异性，能有效区分碱基错配从而实现高特异性。
目前，基于锁核酸（lna）等技术的支撑，科学家研究出了多种有效的microrna检测方法，如northernblotting、微阵列法（micrornaarray)、克隆和测序法、实时荧光定量pcr法等。
1. northern印迹。
从microrna的发现到现在microrna的研究，northern印迹技术一直被应用microrna的鉴定和新microrna的发现。该方法一般是先用聚丙烯酰胺电泳（page）分离出总rna中长度约200bp以内的小rna，然后转移至印迹膜上与标记的寡核苷酸探针进行杂交。探针杂交，经洗膜、显影后对条带进行分析，标记探针有放射性同位素标记和生物素或地高辛等非同位素标记。
虽然northern印迹是当前microrna分析的标准方法，但其缺点是操作繁琐、耗时长、灵敏度低，分析检测时需要大量的样品及分离富集步骤，且对rnase污染非常敏感，实验中每一步操作不当都会影响分析结果。
锁核酸(lna)修饰的杂交探针取代传统dna探针的技术，使northernblotting法的检测灵敏度和特异性得到显著改善。lna（寡核苷酸衍生物）具有高亲和性，可掺入到dna中的任何位置，含有lna的探针与靶分子结合后的双链热稳定性提高，方法灵敏度比普通northern印迹法高10倍，特异性也明显提高。
2.表达谱。
由于micrornas在众多程序的调控，诸如生物发育、细胞增殖和凋亡以及近来被证明与肿瘤发生相关等领域发挥作用，因此micrornas的鉴定和定性研究成为迅速发展的一大研究领域。最典型的鉴定micrornas的方法是检测microrna的表达谱，如果发现某一种microrna在某种特定组织或细胞中特异性表达的话，此microrna将被假定在此特定组织或细胞中发挥某种调控作用。同样，如果某一种microrna在生物特殊发育阶段表达的话，则它有可能是调控发育进程一个主要分子。
微阵列芯片技术(microarray)
microrna的表达谱可以通过克隆特定组织、细胞或者某个生物体特定发育阶段的microrna并测序完成，或者通过芯片检测得以完成。微阵列芯片技术(microarray)是一种高通量的检测方法，能够同时测定多个样本，可以实现microrna的高通量分析，即在一块芯片上同时固定多个与microrna序列互补的探针，然后加入经过标记的样本rna,杂交后进行信号检测。目前，用的最广泛的是基于lna技术的芯片技术，lna探针与普通dna捕获探针相比，可提升熔解温度，自由设计tm值，使得芯片上的所有探针tm值均一化，所有microrna杂交温度一致，保证对所有靶点具有相同的亲和活性。
杂交温度高（60度）避免非特异结合，标记无序列偏向性，效率高，无需富集microrna，因而在灵敏度方面，lna芯片可以检测常规dna探针无法检测到的极其微量的microrna。
至今，很多研究应用该技术建立了不同物种不同组织中microrna的表达谱，亦有研究比较了正常组织和和疾病组织中microrna表达谱的差异。liu等用芯片技术检测了microrna在不同肿瘤细胞中的表达谱，均经northern杂交、qpcr证实。calin等用该技术比较了哺乳动物中b细胞淋巴瘤和正常组织中microrna的表达谱，为microrna在肿瘤临床诊治中的应用提出了新思路。
murakami等用该技术比较肝癌组织和邻近非肿瘤组织micrornas表达谱，发现mir 18和mir 224在肝癌组织中的表达明显上调，而mir 199a、mir 195a、mir 200a和mir 125a在肝癌组织中的表达明显下降。在芯片的基础上，目前已能在特定的细胞中同时检测所有microrna的表达谱，并且能够检测出****固定、石蜡包埋组织中的microrna表达谱，使分析保存标本中的microrna表达谱成为可能。这也使得microrna表达谱特征库建立成为可能。
某些特定的micrornas表达差异已经被证明可以用于精确的**病人的预后。从**的角度，microrna表达谱可能为临床上确定一个**方案提供一个强有力的工具。例如，lu等发现，microrna特征可以成功地对于组织学上难以诊断的癌症样品进行分类。
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