◆鱼病多联抗体苗。
1、安全检验:
检验步骤:5~7克,4~5月龄200尾 —→100尾腹腔注射10倍剂量;100尾不接种作对照 —→观察30日应全部健活若有非特异性死亡,应不超过10尾,且接种组不得超过对照组。
2、效力检验:
检验步骤:5~7克,4~5月龄200尾 —→100尾腹腔注射免疫;100尾浸泡免疫 —→30日后分组攻毒 :
100尾腹腔注射免疫—→分三组每组免疫的20尾,未免疫的对照10尾;100尾浸泡免疫—→分三组每组免疫的20尾,未免的对照10尾。
分别腹腔注射攻3种毒每尾0.1ml(含5个ld50) —观察7日,对照组应至少死亡70%;注射免疫组保护率至少应为60%;浸泡免疫组至少30%
鸡球虫病三价活苗。
半成品。毒力返强试验。
检验步骤:将致弱处理的三种卵囊和强毒株分别接种3日龄雏公鸡各10羽(每羽8000个卵囊)共40羽—→接种6~7天后分别收取卵囊—→再将此卵囊接种3日龄雏公鸡各10羽(每羽8000个卵囊)—→照此方法连续传5代。强毒株对照组也以同样方法连续传5代。
—→第5代接种4~7天后,剖杀所有试验鸡只,—→观察粪便和判定盲肠与小肠病变,—→结果判定:强毒组血便记分为+++强毒组病变记分为+3.5~+4分;致弱组粪便记分不超过+,病变记分≤+1分,判为合格。
成品。1、安全检验。
检验步骤:将3日龄健康无球虫感染的雏鸡30羽分3组(10羽/组)—→分别用10倍和100倍使用剂量免疫其中2组,1组不接种作对照。—→结果判定:
观察4~7天后,10倍量免疫组粪便记分为+,盲肠、小肠等部位病变记分在+1以下;100倍量免疫组无死亡,粪便记分为+~+盲肠、小肠等部位病变记分在+2~+3,对照组无任何肉眼可见病变,疫苗判为合格。
2、效力检验。
检验步骤:将3日龄健康无球虫感染的雏鸡40羽分2组(20羽/组)—→按免疫程序进行免疫,另20羽不免疫作对照。—→在第3次免疫后7天用9×104个强毒卵囊/羽(含三种球虫各3×104个强毒卵囊/羽)攻击两组鸡。
—→结果判定:观察4~7天后,对照组粪便记分为+++病变记分为+4分,死亡率在50%以上;免疫组无血便,无死亡,病变记分在+1以下,疫苗判为合格。
3、同笼试验。
检验步骤:将3日龄健康无球虫感染的雏鸡20羽分2组(10羽/组)—→1组按免疫程序进行免疫,另1组不免疫(做标记)。—两组鸡一起平养,至第3次免疫后的4~7天,观察试验鸡粪便并剖杀所有试验鸡,观察肠道病变。
—→结果判定:所有试验鸡(含未免疫鸡)应无血便(+)盲肠、小肠病变记分均应在+1分以下,疫苗判为合格。
猪多杀性巴士杆菌病活疫苗。
1、安全检验。
1)小鼠检验: 18~22克小白鼠5只—→皮下注射0.2 ml(含1/ 30头份)—→观察10日应全部健活。
2)豚鼠检验: 300~400克豚鼠2只—→皮下注射2ml(含15头份)—→观察10日应全部健活。
2、效力检验: 16~18克小鼠16只—→10只皮下注射0.2 ml(含1/ 150头份);对照6只—→14日后10免疫和3只对照各皮下注射c44-1株强毒液30~40mld;另3只对照注射1mld—→观察10日:
注射30~40mld的对照组小鼠应全部死亡;注射1mld的对照组小鼠应至少死亡2只;免疫组小鼠应至少保护8只。
鸡痘活疫苗。
1、安全检验。
检验步骤:1~14日龄spf鸡10只—→各肌肉注射0.2 ml(含10羽份)—→观察10日应全部健活。
2、效力检验。
检验步骤:按瓶签注明羽份,将疫苗用生理盐水稀释至1羽/0.2ml—→再进行10倍系列稀释—→取3个适宜稀释度经绒毛尿囊膜分别接种11~12日龄spf鸡胚5枚(共15枚)每胚0.
2 ml—→37℃继续孵育96~120h—→鸡胚绒毛尿囊膜水肿增厚或出现豆斑判为感染—→计算eid50,每羽份病毒含量应不低于103.0 eid50.
鸡新城疫低毒力活疫苗。
1、安全检验:2~7日龄spf鸡20只—→10只滴鼻免疫0.05ml(含10羽份);10只不接种对照—→同条件分别饲养10日,因无不良反应(如有非特异性死亡,免疫对照组均不得超过1只)
2、效力检验:按瓶签注明羽份,将疫苗用生理盐水稀释至1羽/0.1ml—→再进行10倍系列稀释—→取3个适宜稀释度分别尿囊腔接种10日龄spf鸡胚5枚(共15枚)每胚0.
1 ml—→37℃继续孵育120h—→48h前弃去;48~120h内死亡鸡胚收获尿囊液(同一稀释度等量混合)分别测定红细胞凝集价;120h活胚逐个测红细胞凝集价(微量法不低于1:128者判为感染)—→计算eid50,每羽份病毒含量应不低于106.0 eid50.
3、鉴别检验。
检验步骤:将疫苗用生理盐水稀释至105.0 eid50/0.
1ml—→与等量抗鸡新城疫特异性血清混合—→室温作用60min—→尿囊腔接种10日龄spf鸡胚10枚,每胚0.1 ml—→37℃继续孵育120h—→24~120h内应不引起特异性死亡,且至少存活8枚;—→每枚鸡胚红细胞凝试验应为阴性。
支原体检验。
一、培养基。
1、检验禽源细胞和由禽胚组织或其细胞制成的活疫苗用改良frey氏培养基。
2、检验其他种类细胞和病毒疫苗用支原体培养基。
3、检验血清用无血清支原体培养基。
二、检查法。
1、样品处理。
每批样品取5瓶。液体制品混合后备用;冻干制品,则加液体培养基或生理盐水复原成混悬液后混合。检测血清时,用血清直接接种到不含血清的培养基内。
2、培养基准备。
2.1 液体培养基将冷冻保存的液体培养基融化,分装到小瓶,20ml/瓶;小管1.8ml/支。
2.2 固体培养基将固体培养基加热溶解,温度降至60℃左右时添加辅助液;按平皿规格倒入适量培养基。
2.3 培养基需要量。
每批样品需要用液体培养基:小瓶1个;小试管2支,平皿2付。
阳性对照需要用液体培养基:小瓶1个;小试管2支,平皿2付。
阴性对照需要用液体培养基:小瓶1个;小试管2支,平皿2付。
3、对照。阳性对照禽类疫苗用滑液支原体,其它疫苗用猪鼻支原体做阳性对照。
阴性对照用同批培养基作阴性对照。
4、疫苗检测。
1)接种与观察。
取5ml疫苗混合物接种于装有20ml液体培养基的小瓶,摇匀后,再从小瓶中取0.8ml移植到2支小管液体培养基(0.2ml/支);2付固体培养基(0.
1~0.2ml/付)。液体培养物(小瓶与小管)置37℃培养,固体培养物(平皿)置含5%co2培养箱培养。
每日观察培养物有无颜色变化(变黄或变红),观察14日。
分别于接种后5日、10日、15日从小瓶中取0.8ml培养物移植到2支小管液体培养基(0.2ml/支);2付固体培养基(0.
1~0.2ml/付)。每次移植培养物均观察14日。
在观察期内,如果发现小瓶或任何一支小管液体培养物颜色出现明显变化,即ph值变化达±0.5时,应立即移植于小管液体培养基2支和固体培养基2付。观察移植的液体培养基是否出现恒定的ph值变化;固体培养基培养3天后在40—100倍显微镜下观察有无典型的“煎蛋”状支原体菌落出现,经14日观察,仍无菌落者时,停止观察。
每次移植培养必须设阳性和阴性对照,在相同条件下培养观察。阳性对照:禽类疫苗用滑液支原体,其它疫苗用猪鼻支原体做阳性对照。阴性对照:用同批培养基作阴性对照。
6、检验操作示意图。
样品3~5ml
20ml/瓶→0.2ml/小管 → 14天。
↓ ↘0.1~0.2 ml/小管
5天 →0.2ml/小管 → 14天。
↓ ↘0.1~0.2 ml/小管。
10天→0.2ml/小管 → 14天。
↓ ↘0.1~0.2 ml/小管。
15天→0.2ml/小管 → 14天
↘0.1~0.2 ml/小管。
三、结果判定。
1、阳性对照至少有一个平板出现支原体菌落,而阴性对照中无支原体生长,则检验有效。
2、接种样品的任何一个琼脂平板上出现支原体菌落,液体培养基ph值发生变化时,判疫苗或血清不合格。
外源病毒检验。
一、样品处理。
1、种毒:鸡新城疫低毒力(lasota) 种毒:种毒病毒含量/外源病毒检验时要求的含量(一般为10羽份/0.1ml)=该种毒的稀释倍数—→与等量抗血清中和。
鸡痘种毒:球虫种毒:
2、成品:鸡新城疫低毒力活疫苗:取样3瓶(500羽/瓶)—→每瓶加m199溶液5 ml(100羽/ml即10羽/0.
1ml)—→各瓶取样2ml混合(共6ml)—→取混合样2.5ml与2.5ml抗血清等量中和(37℃中和1h其间摇数次)
鸡痘活疫苗:取样3瓶(500羽/瓶)—→每瓶加5 ml(100羽/ml即10羽/0.1ml)—→混合样品冷冻离心(4℃,1200g,15min)—→取上清液经0.
8um、0.45um、0.22um、0.
1um滤器各过滤1次。
鸡球虫病三价活疫苗:取样3瓶(500羽/瓶)—→混合样品冷冻离心(4℃,12000g,15min)—→取上清液经0.8um、0.
45um、0.22um、0.1um滤器各过滤1次—→用m199溶液稀释至10羽/ml
二、接种、观察及判定。
1、鸡胚检查法:
10日龄spf鸡胚20枚—→10枚尿囊腔(as),10枚尿囊膜(cam)接种0.2 ml/胚—→37℃继续孵育,观察7日—→弃去24h内死胚(但每组须活8/10以上实验成立)—→结果:胎儿应发育正常,绒毛尿囊莫无病变;鸡胚液血凝试验应为阴性。
2、细胞检查法:
6瓶长成良好单层的细胞瓶(100 ml容量瓶)—→2瓶接种已处理的样品0.2ml/瓶37℃吸附1h换上维持液(?)2瓶接lasota病毒(104 eid50/瓶);2瓶不接种作阴性对照—→37℃继续培养5~7天,每天观察应无任何cpe—→培养结束后,弃去培养液,用pbs( )轻洗细胞面3次—→每瓶细胞加0.
1%(v/v)鸡红细胞液0.5 ml覆盖细胞面—→4℃放置1h—→再用pbs轻洗细胞面2次—→普通显微镜下观察:阳性对照应有典型红细胞吸附现象;阴性对照应无血球吸附现象;样品细胞不应出现红细胞吸附现象。
禽白血病病毒(r**)检验。
一、样品处理。
鸡新城疫低毒力活疫苗:取样1瓶(500羽/瓶)—→加不含血清的m199溶液2ml(250羽/ml即200羽/0.8ml)—→取0.
8ml(含200羽份)与0.8mlndv抗血清等量中和(37℃中和1h其间摇数次)—→全部接种到细胞瓶中。
鸡痘活疫苗:取样2瓶(500羽/瓶)—→加不含血清的m199溶液2ml/瓶(250羽/ml即500羽/2ml)—→混合样品冷冻离心(4℃,12000g,15min)—→取上清液经0.8um、0.
45um、0.22um和0.1um滤器各过滤1次—→取滤液2ml(相当于500羽份)用于接种cef
二、接种与培养。
cpe接种后,37℃吸附1h—→弃去接种液,加生长液—→次日换成维持液(注:同时设立正常细胞作阴性对照;禽白血病病毒(r**)作阳性对照。)
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