生化实验讲义。
鹿敏、聂桓。
哈工大理学院生命科学与工程系。
实验一蛋白质与氨基酸的呈色反应
蛋白质的呈色反应是指蛋白质所含的某些氨基酸及其特殊结构，在一定条件下可与某些试剂发生了生成有色的物质的反应。
不同蛋白质分子所含的氨基酸残基也是不完全相同，因此所发生的成色反应也不完全一样。另外呈色反应并不是蛋白质的专一反应，某些非蛋白质类物质（含有-cs-nh、-ch2-nh2、-crh-nh2、-choh-ch2nh2等基团的物质）也能发生类似的颜色反应。因此，不能仅仅根据呈色反应的结果为阳性就来判断被测物质一定是蛋白质。
注意：本次实验为定性实验，试剂的量取用滴管和移液器完成。
1 【实验目的】：
1）了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式。
2）了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。
3）学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。
2 【实验原理】：
一）双缩脲反应。
当尿素经加热至180℃左右时，两分子尿素脱去一分子氨，进而缩合成一分子双缩脲。其在碱性条件下双缩脲与铜离子结合成红紫色络合物，此反应称为双缩脲反应。其反应过程如下：
多肽及蛋白质分子结构中均含有许多肽键，其结构与双缩脲分子中的亚酰胺键相同。因此，在碱性条件下与铜离子也能呈现出类似于双缩脲的呈色反应。可用于蛋白质的定性或定量测定。
其反应过程如下：
双缩脲反应不仅为含有两个以上肽键的物质所有。含有一个肽键和一个—cs—nh2，—ch2—nh2，—crh—nh2，—ch2—nh2—chnh2—ch2oh或—chohch2nh2等基团。
nh2 nh2
的物质以及乙二酰二胺（o＝c——c＝o）等物质也有此反应。nh3也干扰此反应，因为nh3与cu2+可生成暗蓝色的络离子cu（nh3）42+。一切蛋白质或二肽以上的多肽部有双纳脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。
二）茚三酮反应。
除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有α—氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。整个反应分两步，第一步是氨基酸被氧化形成co2、nh3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。此反应的适宜ph为5—7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同ph条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。
该反应十分灵敏，1∶1 500 000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。
此反应机理如下：
第一步：第二步：
三）黄色反应。
在蛋白质分子中，含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成深橙色的硝醌酸钠。多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量浓硫酸才有黄色反应。
反应为：一定要加入10％氢氧化钠溶液至碱性，才会进一步形成深橙色的硝醌酸钠。
四）坂口反应。
蛋白质在碱性溶液中与次氯酸盐（或次溴酸盐）和α-萘酚作用产生红色的产物。这是由于蛋白质分子中精氨酸胍基的特征反应。许多胍的衍生物如胍乙酸、胍基丁胺等也发生此反应。
精氨酸是唯一呈正反应的氨基酸，反应灵敏度达1：250000。生成的氨可被次溴酸钠氧化生成氮。
在次溴酸钠缓慢作用下，有色物质继续氧化，引起颜色消失，因此过量的次溴酸钠对反应不利。加入浓尿素，破坏过量的次溴酸钠，能增加颜色的稳定性。
此反应可以用来定性鉴定含有精氨酸的蛋白质和定量测定精氨酸的含量。
五)乙醛酸反应。
在浓硫酸存在下，色氨酸与乙醛酸反应生成紫色物质，反应机理尚不清楚，可能是一分子乙醛酸与两分子色氨酸脱水缩合形成与靛蓝相似的物质。血清球蛋白含色氨酸残基的量较为稳定，故临床生化检验可用乙醛酸反应来定性测定球蛋白量。
六)偶氮反应。
偶氮化合物与酚核或咪唑结合生成有色物质，它与酪氨酸和组氨酸反应的产物分别为红色和樱桃红色，含有酪氨酸的蛋白质也有此反应。它受到酪胺、组胺、肾上腺素和胆色素的干扰。
3 【实验试剂】：
1）测试材料：
2%鸡卵清蛋白溶液、大豆提取液、0.5%酪蛋白溶液、1%白明胶溶液、黄豆提取液、脲、0.5%苯酚溶液、0.
3%酪氨酸溶液、0.3%色氨酸、0.3%苯丙氨酸、0.
3%半胱氨酸、10mg/ml精氨酸、10mg/ml组氨酸。氨基酸未知物1，未知物2，未知物3。
2）试剂：双缩脲试剂、hopkins-cok乙醛酸试剂、ehrlich重氮试剂、10%naoh溶液、20%naoh.1%茚三酮乙醇溶液、1% α萘酚乙醇溶液、次溴酸钠溶液、浓硫酸、浓hno3。
3）器材：试管（每组9个试管，清洗、重复使用。标签纸贴上样本名称）、试管架、试管夹、胶头滴管、滤纸、酒精灯、剪刀、水浴锅、吹风机、喷雾器、毛细管、标签纸、移液器（1ml）及枪头、移液管。
4 【实验步骤】：
1） 蛋白质反应。
2） 氨基酸反应。
5【实验记录】：
在**中描述颜色变化，以来表示深浅程度。
表1-1 蛋白质实验结果。
表1-2 氨基酸实验结果。
6【思考题】
实验二：蛋白质浓度测定---folin-酚试剂法。
1 【实验目的】
1、熟悉分光光度法的应用；
2、掌握 folin- 酚试剂法测定蛋白质含量的原理和方法；
3、学会制作标准曲线，并通过标准曲线求未知浓度样品溶液中蛋白质含量。
2 【实验原理】
目前蛋白质含量测定有两类方法，一类是利用蛋白质的物理化学性质，如折射率、比重、紫外吸收等测定得知；另一类是利用化学方法测定蛋白质的含量，如微量凯氏定氮法、双缩脲反应、folin- 酚试剂法（又名lowry法）。这两类方法各有优缺点，选用何种方法测定蛋白质含量，可依据实验要求及实验室条件进行选择。目前实验室多用folin- 酚法测定蛋白质含量。
folin—酚试剂法最早是由lowry确定的测定蛋白质浓度的基本方法。以后在生物化学领域得到广泛的应用。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。
此法的优点是操作简单、迅速、不需要特殊仪器设备、灵敏度高，较紫外吸收法灵敏10-20倍，较双缩脲法灵敏100倍。反应约在15min内有最大显色，并至少可以稳定几小时。其不足之处是此反应受多种因素干扰。
在测试时应排除干扰因素或做空白管实验消除。费时较长，要严格控制操作时间。
此法是在双缩脲反应的基础上发展起来的，凡是干扰双缩脲反应的基团，如-co-nh2，-ch2-nh2，-cs-nh2以及在性质上是氨基酸或肽的缓冲剂，如tris缓冲剂以及蔗糖、硫酸铵、巯基化物均可干扰folin- 酚反应。此外，所测蛋白质样品中若含酚类或柠檬酸，均对此反应有干扰作用。而浓度较低的尿素 (0.
5 ％左右 ) 胍 (0.5 ％左右 ) 硫酸钠 (1 ％ 硝酸钠 (1 ％ 三氯乙酸 (0.5 ％ 乙醇 (5 ％ 乙醚 (5 ％ 丙酮 (0.
5 ％ 等溶液对显色无影响。这些物质含量高时，必须做校正曲线。含硫酸铵的溶液只需加碳酸钠 - 氢氧化钠溶液即可显色测定。
若样品酸度较高，显色后色浅，则必须提高碳酸钠 - 氢氧化钠溶液的浓度 1 ~ 2 倍，这样既可纠正显色后色浅的弊病。
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