蛋白质含量测定依法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩脲法（biuret法）、folin－酚试剂法（lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（bradford法）。
其中bradford法和lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。
每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。
双缩脲法：原理是蛋白质含有两个以上的肽键（-co-nh-）因此，有双缩脲反应，在碱性溶液中蛋白质与cu2+形成紫色络合物，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，而与蛋白质的相对分子质量及aa成分无关，故可以用来测定蛋白质含量；
folin-酚试剂法（lowry法）：
是双缩脲法的发展，第一步涉及到碱性溶液中铜蛋白质复合物的形成，然后这个复合物还原磷钼酸－磷钨酸试剂，产生深蓝色（钼蓝和钨蓝混合物）比双缩脲法灵敏，但费时；
紫外吸收法：蛋白质中一些氨基酸残基中的苯环含有共轭双键，所以蛋白质具有吸收紫外光的性质，最大吸收峰在280nm处，在一定范围内，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质含量成正比，可用作定量测定，简单、灵敏、快速、不耗样品，低浓度的盐类不干扰。
考马斯亮蓝法（bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用蛋白质的存在会影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化，从而改变这些染料的光吸收，在此基础上发展了蛋白质染色测定方法涉及的甲基橙、考马斯兰亮蓝、溴甲酚绿和溴甲酚紫。目前广泛使用的染料是考马斯亮蓝。考马斯亮蓝g-250染色法测定蛋白质含量属于染料结合法的一种，考马斯亮蓝g-250在酸性溶液中，游离状态下为棕红色，当它与蛋白质通过范德华键结合后，变为蓝色，蛋白质染料复合物对595nm可见光有最大光吸收，在一定范围内（10-1000μg/ml）其od595nm值与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。
实验三动物肝脏dna的制备和鉴定。
一、实验目的：
1、学习并掌握动物组织dna的提取方法及其原理。
2、掌握琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理和方法。
3、学习核酸染色的方法。
二、实验原理：
1．脱氧核糖核酸（dna）的制备。
脱氧核糖核酸（dna）在细胞内部都与蛋白质结合成复合物形式存在，分离dna时必须使其与蛋白质解离，并除去蛋白质。除去蛋白质主要有2种：（1）用氯仿一异成醇混合液振荡核蛋白溶液，使蛋白质变性，然后离心除去变性蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而dna溶于上层水相。
用两倍体积 95％乙醇溶液可将dna钠盐沉淀出来。（2）用十二烷基硫酸钠（sds）等去污剂使蛋白质变性，可以直接从生物材料中提取dna。
脱氧核糖核蛋白在浓nacl（1-2mol／l）溶液中溶解度很大，但在0.14mol／l nacl溶液中溶解度很低，而核糖核蛋白则溶于0.14mol／l nacl溶液中(当然也溶于浓nacl（1-2mol／l）溶液中)，利用这一性质可将脱氧核糖核蛋白与绝大部分核糖核蛋白分离开来。
为了防止dna酶的降解，提取时可加入适量edta（乙二胺四乙酸）、柠檬酸，以降低dna酶的活性。加入rna酶降解剩余的rna，获得纯的dna。将dna于滤纸上干燥，溶于1mlte中低温保存。
2．脱氧核糖核酸（dna）的分离鉴定——琼脂糖凝胶电泳技术。
1）电泳定义：是指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。根据电泳支持介质的不同，可分为滤纸，醋酸纤维薄膜，淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。
电泳技术的应用非常广泛，从分离小分子如氨基酸、肽、激素、核苷酸到复杂的大分子如蛋白质、核酸甚至病毒颗粒的分离鉴定都依赖于电泳技术。
2）琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理：
琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖凝胶作为支持介质的一种电泳分离方法，是一种简便、快速分离鉴定核酸的方法，已成为分子生物学及基因工程研究中常用实验方法之一。
琼脂糖英文名agarose，是从琼脂中提取出来的，由半乳糖和3.6-脱水-l- 半乳糖相互结合的链状多糖。琼脂糖和琼脂都可在不同浓度的水溶液下可形成多孔的凝胶，电泳中具有分子筛效应。
但琼脂糖含硫酸根比琼脂少，电渗作用降低，因而分离效果明显提高。
dna分子在ph高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动（电荷效应） 。
dna分子泳动速率的大小除与dna分子的带电量有关外，还与dna分子的大小和空间构象有关（琼脂糖凝胶的分子筛效应）。
电泳时，用溴酚蓝做前沿指示剂，用溴乙啶 （ethidium bromide，eb） 指示dna样品在凝胶中的确切位置。溴乙啶是一种荧光染料，可插入dna双螺旋结构的两个碱基对之间，与dna分子形成络合物，在紫外光的激发下发出橙黄色的荧光。荧光来自两方面，一是核酸吸收260nm的紫外光，并将能量传给eb；二是eb本身吸收波长为302nm和360nm的紫外光。
这两方面的能量最终激发eb发出波长为590nm的红橙色荧光。溴乙啶可加入凝胶中，也可以在电泳后，将凝胶放在含eb的溶液中浸泡，但小分子dna浸泡时间过长容易引起扩散。溴乙啶检测dna的灵敏度很高，可检出10ng甚至更少的dna。
3）琼脂糖凝胶电泳分离核酸的影响因素。
核酸大小与琼脂糖凝胶电泳分离的关系。
凝胶中，dn**段迁移率与dna分子大小(碱基对的对数)成反比(≤ 20kb) ，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。
核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系。
不同构型dna的移动速度次序为：闭环dna>直线dna>开环的双链环状dna(当琼脂糖浓度太高时，环状dna不能进入胶中)。
不同大小的dna需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。
琼脂糖浓度0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
线状dna大小/kb 60-5 20-1 10-0.8 7-0.5 6-0.4 3-0.2 2-0.1
注：dn**段在5-500bp之间时，一般用聚丙烯酰胺凝胶电泳（page）进行电泳分离。
4）琼脂糖凝胶电泳具有以下优点：
操作简单、制备容易快速、凝胶机械性能好、电泳速度快、分离dn**段范围广、样品不需事先处理就可以进行电泳。
② 凝胶结构均匀，对样品吸附小，电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。
③ 琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光检测及定量测定。
④ 电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。
因此，琼脂糖凝胶电泳已成为分子生物学及基因工程研究中常用实验方法之一， dna样本的分离、纯化、鉴定以及相对分子质量测定常用琼脂糖凝胶电泳。
3 dna荧光染料eb染色的原理和优点是。
1）、原理：
eb：即3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲锭溴盐(ethidium bromide)。 eb是一种扁平分子，它可以嵌入核酸双链配对碱基或碱基对之间，在紫外线激发下，发出红橙色荧光。
生物化学实验考核方案
一 考核方案。一 成绩组成。成绩总分100分。其中技能操作满分40分 实验报告及实训总结满分为20分 平时上课表现满分10分 笔试成绩满分30分 二 技能考核的内容 1.脂肪提取器的使用操作方法2.凯氏定氮仪的使用操作方法3.滴定分析仪器的使用和操作技术4 索氏提取器的安装和各部件的作用5 微量蒸馏...
生物化学作业
第一章 第四章。一 名词解释1.标准氨基酸2.肽键。3.蛋白质的一级结构4.螺旋5.亚基。6.蛋白质的等电点7.蛋白质的变性8.5 核苷酸的熔点10.增色效应11.酶蛋白12.辅酶。13.酶的活性中心14.同工酶。15.酶的最适温度16.酶的最适ph值。18.竞争性抑制剂。19.酶的不可逆抑制作用2...
《生物化学》作业
生物化学 作业。一 单选题 1 蛋白质变性是由于 d a 蛋白质氨基酸组成的改变b 蛋白质氨基酸顺序的改变c 蛋白质肽键的断裂d 蛋白质空间构象的破坏e 蛋白质的水解。2 温度对酶促反应的影响，正确的是a a 温度愈高酶促反应愈快b 存在最适温度。c 低温时酶变性而失活d 酶通常应保存在室温的环境中...