一、植物组织中sod活力和丙二醛含量的测定的测定。
二、植物材料中o2—的测定(羟胺法)
三、 植物激素的提取、分离与纯化。
四、 植物激素含量的酶联免疫检测（elisa）
实验一植物组织中sod活力的测定。
一、原理。超氧物歧化酶（superoxidedismutase, sod）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶，它催化下列反应：
因其催化底物为一不稳定自由基，至今为止对sod活性的检测均用间接方法进行，在检测系统中一般都包括两个子系统，一个是产生o2的系统，另一个是与o2，反应并能够检测的系统，从sod干扰后一系统的反应来测定酶活性。本方法以核黄素在有氧条件下光化还原作为产生系统，根据氯化硝基四氮唑蓝（nbt）可与反应，还原成蓝色的甲腙，建立检测系统，该产物在560nm下有最大吸收。当sod加入后，所催化的歧化反应抑制了nbt的还原，使蓝色甲腙生成速率减慢，一定时间后测定560nm光密度的变化，与未加sod的反应系统比较，以抑制nbt光还原的50%作为一个活力单位，计算sod活性。
二、材料、仪器设备及试剂。
一）材料。植物叶片。
二）仪器设备。
高速台式离心机，分光光度计，微量进样器，荧光灯（反应试管处照度为4000 lx），微烧杯数个。
三）试剂。1）0.1mol. l-1ph7.8的磷酸氢二钠与磷酸二氢钠缓冲液，待用。
2）0.039mol. l-1的蛋氨酸磷酸缓冲液，按浓度要求称取蛋氨酸溶于（1）液中，现用现配。
3）1.125mmol. l-1氯化硝基四氮唑兰（nbt）溶液，现用现配。
4）3.0mol. l-1 edta的60mol. l-1核黄素溶液，注意用黑纸包上瓶遮光保存。
5）0.05 mol. l-1ph7.8磷酸钠缓冲溶液。
三、实验步骤。
1．酶液提取。
取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，加1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml，于13000g下离心20min，上清液即为sod粗提液。
2．测定：取5ml微烧杯（要求透明度好）4个，2个为测定管，另2个为对照管，按表2-1加入各溶液。
表2-1 反应系统中各试液的取量（ml）
试液全部加入后，充分混匀，除1号杯外，其余均在4500lux日光灯下照光5分钟，然后立即遮光，于560nm下测定光密度，以1号杯液凋零号杯液测定值作为还原率100%，分别计算不同酶液量的各反应系统中抑制nbt光还原的相对百分率，作出二者相关曲线，（以酶液浓度为横坐标，以抑制nbt光还原相对百分率为纵座标），找出50%抑制的酶液量，以此酶液量为一个酶活单位。
四、结果计算。
有时因测定样品量多，每个样品均按此法得出酶活单位工作将会很大，也可每个样品只测1或2个酶液量的光密度值，从而计算出酶活单位。
式中d1为号杯的平均密度值。
d2为测定样品的光密度值。
实验二植物组织中丙二醛含量的测定。
一、原理。植物器官衰老时，或在逆境条件下，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛（malondialdehyde，mda）是其产物之一，通常利用它作为脂质过氧化指标，表示细胞膜脂过氧化程度和植物对逆境条件反应的强弱。
mda在高温、酸性条件下与硫代巴比妥酸（tba）反应，形成在532nm波长处有最大光吸收的有色三甲基复合物，该复合物的吸光系数为155[mmol/(l·m)]，并且在600nm波长处有最小光吸收。可按公式。
a532－a600＝155000×c×l
算出mda浓度c（mol/l），进一步算出单位重量鲜组织中mda含量c（mol/g）。式中a532和a600分别表示532nm和600nm波长处的吸光度值。l为比色杯厚度（cm）。
需要指出的是，植物组织中糖类物质对mda－tba反应有干扰作用。为消除这种干扰，经试验，可用下列公式消除由蔗糖引起的误差。
c（mol/l）＝6.45（a532－a600）－0.56a450
式中a450、a532、a600分别代表450nm、532nm和600nm波长下的吸光度值。用公式（2）可直接求得植物样品提取液中mda的浓度，进一步算出其在植物组织中的含量。
二、材料、仪器设备及试剂。
0.5%硫代巴比妥酸的20%三氮乙酸溶液。
三、操作方法。
1．吸取1.5ml以上提取液（即测sod的提取液）于刻度试管中，加入2.5ml 0.
5%硫代巴比妥酸的20%（w/v）三氯乙酸溶液，于沸水浴上加热30分钟，迅速冷却，1800g离心10分钟，上清液测532nm和600nm的消光度。
2．结果计算。
1.55×10-1为丙二醛的mol消光系数。
在有产生的植物体系中，加入nh2oh，可使nh2oh氧化成n02－，no2－生成量与体系中产生的量成正比关系。no2—和对氨基苯磺酸反应生成重氮化合物，重氮化合物与α一萘胺反应生成粉红色的偶氮染料。
此染料在波长530nm处有明显吸收峰，因此，只要测得样品材料a530值，在标准曲线上查出相应[no2－]，根据反应方程式①中no2－和的关系，即可算出量。当进行不同处理比较时，可以通过测试材料的重量和no2－培育时间，求出样品产生速率(nmol／min·gfw)。
no2－在1～25μmol/l内和对氨基苯磺酸与α一萘胺显色反应呈线性关系。
1．材料：植物叶片或其他组织：
2．仪器：①分光光度计；②离心机；③恒温水浴或恒温箱；④真空泵。
3．药品：①50nmol/l磷酸缓冲液ph7.8:
取a液(3.12g nah2po4·2h2o配成100ml)8.5ml，b液(7.
17g na2hpo4·12h2o配成100ml)91.5ml混合后定容至400ml即可。②10mmol/l盐酸羟胺：
称取6.9mg nh2oh·hcl用磷酸缓冲液ph7.8配成100ml(现用现配)；③17mmol·l-1对氨基苯磺酸：
称取0.2944g对氨基苯磺酸，用30％乙酸微加热溶解后定容成100ml；④100zmol·l-1亚硝酸钠；取6.9mg亚硝酸钠用蒸馏水配成1000ml；⑤7mmol·l-1 α一萘胺：
取α一萘胺0.1g用少量30％乙酸溶解后，用蒸馏水配制成100ml。
1．no2－标准曲线的制作：取7支试管，按表1加入各试剂用量，加完试剂摇匀，10分钟后测a530，以1号试管溶液调零。以no2－浓度为横坐标，a530值为纵坐标绘制标准曲线(表12-3)。
表12-3 制作n2－标准曲线个试剂用量（ml）
2．样品测定：①n02—的培育：取试材样品lg，放入10ml试管中并加入5ml 10mmol·l-1盐酸羟胺，真空渗入后，将试管置于30℃温箱中温育45分钟，以使样品体内产生的与nh2oh·hcl充分反应，生成n02—。
显色测定：样品温育结束后，从样品试管中吸取2ml溶液，与1ml对氨基苯磺酸和lml α一萘胺充分混合，约10分钟完成显色反应，显色后的混合液，如有混浊可在2500×g条件下离心10分钟，取上清液测a530。
以50mmol·l-1磷酸缓冲液2ml ph7.7，对氨基苯磺酸lml，α一萘胺1ml混合后调零。
3．结果计算：测得样品a530值后，在标准曲线上查出相应的no2－浓度，然后进行计算。
式中：4为反应体系毫升数。
v 为样品提取液总量(ml)
a 为测定用样品提取液量(ml)
实验四植物激素的提取、分离与纯化。
植物生长物质是一类调节和控制植物生长发育的物质。可分为两大类：一类是植物激素；另一类是植物生长调节剂。
植物激素是指植物自身代谢产生的具有高度生理活性的微量有机物，在植物生长发育和环境反应中起重要的调节作用。目前，国际上公认的植物激素有5大类，即：生长素类、赤霉素类，细胞**素类、脱落酸类和乙烯。
植物内源激素在体内的含量甚微，一般约为组织鲜重的10-9～10-7，即在微克(μg)或毫微克(ng)水平。
在植物生长物质效应和作用机理研究中，需要精确地测定它们在植物体内的含量和变化动态。现已建立生物检测、仪器分析和免疫测定三大类方法体系。但精确检测的前提是有效的提取植物体内的激素。
将极其微量的激素从植物样品中提取分离出来，需要经过较复杂的流程，这就要求熟练掌握技术，在操作上要环环相扣，尽可能缩短时间，减少实验误差，才能获得较高的激素得率和纯度，为后续的检测奠定基础。
本实验介绍植物激素的提取、分离、纯化。方法主要基于中国农业大学生产的elisa试剂盒说明书。
原理。植物激素生长素（iaa）、细胞**素（ctk）、赤霉素（ga）及脱落酸（aba）等难溶于水，溶于有机溶剂，因此可用80%甲醇溶液一并提取，然后分别用于上述激素的含量测定。
材料、仪器设备及试剂。
1．材料。植物、真菌、藻类等组织或器官。
2．仪器设备。
高速冷冻离心机，冰箱，台式快速浓缩干燥器或氮气吹干装置，c-18柱，自动微量进样器，离心管，研钵或匀浆器（预冷），冰盒，试管，微烧杯。
3．试剂。1）提取液：80％甲醇，内含1mmol／l bht(二叔丁基对甲苯酚，为抗氧化剂)。
由于bht不易溶于80％甲醇，需先用甲醇溶解bht，再用蒸馏水调至80％。
2）80％甲醇：平衡c-18柱。
3）100％甲醇：清洗c-18柱。
4）100％乙醚：清洗c-18柱。
5）磷酸盐缓冲液(pbs)：称取8.0g nacl，0.
2g nah2po4，2.96g na2hpo4·12h20，溶解后用蒸馏水定容至1000ml，ph为7.5 (若药品及称量无误，一般不必调ph)。
6）样品稀释液： 在100 ml pbs中加0.1ml tween-20，0.1g白明胶 (稍加热溶解)。
7）液氮（取样时尽可能使用液氮固定）
缓冲液均置于4℃冰箱贮存，最长一周，若发现缓冲液出现絮状，应重新配制。
操作步骤。1．取样。
elisa法要求样品集中检测，以增大相互之间的可比性。因此，若分次取样，必须迅速称重、包装、标记，用液氮冷冻15min后，置于－20℃冰箱中保存。若无液氮，可迅速称重、包装、标记后置于－40℃冰箱贮存。
样品可保存一年。
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