《分子生物学》作业一第2-4章/第8章。
1. 什么是snp？试述研究snp的意义。
全称single nucleotide polymorphisms，是指在基因组dna上单个碱基的变异引起的dna序列多态性。是人类可遗传变异中最常见的一种。。snp自身的特性决定了它更适合于对复杂性状与疾病的遗传解剖以及基于群体的基因识别等方面的研究：
1）、 snp数量多，分布广泛。
2）、 snp适于快速、规模化筛查。
3）、 snp等位基因频率的容易估计。
4）、 易于基因分型。snps 的二态性，也有利于对其进行基因分型。
对snp的深入研究具有以下几方面意义：
1） 由于snp的低突变率、高密度、易于检测的特性，使得它在遗传学分析中得到广泛应用；
2）snp具有已知性、可遗传性、可检测性，研究snp可用于疾病基因的定位、克隆和鉴定。寻找疾病相关的突变位点，发展疾病预防策略，3）研究snp本身对机体的影响，尤其是疾病的易感性，从而个性化医疗。通过对药物靶点个体差异性分析，个性化药物、方法**。
4）法医学研究。法医检验中可以用dna芯片分析snp位点，应用于亲权鉴定等；
5) 器官移植中供体/受体配对分析。对snp的研究将有助于解释个体的表型差异、不同群体和个体对疾病特别是对负责疾病如肿瘤、某些遗传疾病、糖尿病、自身免疫性疾病等的易感性和疾病的关联基因，此外还在法医学和致病基因的搜寻中发挥重大作用。
2. orf
开放阅读框架 (open reading frame，orf)：在dna链上，由蛋白质合成的起始密码开始，到终止密码为止的一个连续编码序列。
3. 调节基因指一段有效地dn**段，他通过转录、翻译而产生调节蛋白，该蛋白与操纵基因相互作用，从而对操纵子的活动进行控制。
4. 请介绍目前蛋白质组学研究中最常用的基本技术流程并简述其原理。
蛋白质组学常用的研究方法有双向凝胶电泳和质谱技术，基于凝胶的工作流程是目前使用的较为广泛的、发展最为成熟的工作流程。
1）样品制备—样品**于细胞、组织、体液等。也可采用全蛋白或进行预分级（线粒体、高尔基体、叶绿体、膜蛋白、核蛋白等）以提高低丰度蛋白质的上样量及检测灵敏度。应注意尽可能扩大蛋白质的溶解度和解聚，以提高分辨率。
2）样品分离—双向凝胶电泳（two-dimensional electrophoresis，2-de）：利用蛋白质的等电点与分子量差异分离之。第一向：
等电聚焦 ief 第二向：sds-page。
3）染色方法考马斯亮蓝染色、银染（不含戊二醛）、荧光染色（cy3、cy5），放射性同位素标记等。
5. 简述酵母双杂交技术的原理。
答：很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构域，即dna特异结合域（bd）与转录激活域（ad）。这两个结构域各具功能，互不影响。
但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域，否则无法完成激活功能。不同**激活因子的bd区与ad结合后则特异地激活被bd结合的基因表达。基于这个原理，可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。
如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使ad与bd形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。
6. 分子克隆技术包括哪些基本步骤？目的基因和载体连接主要有哪些方法？
基本步骤。一、目的基因的获取。
二、载体的选择。
三、目的基因和载体的酶切与连接。
四、重组dna导入受体细胞。
五、重组体的筛选和鉴定
目的基因和载体连接方法主要有。
一)粘性末端连接，用dna连接酶连接具有互补粘性末端的dn**段；本法适用于在质粒和目的基因上有相同单或双酶切位点；
二) 平末端连接，质粒和目的基因上没有相同单或双酶切位点，人工接头，通过同聚尾连接；用t4dna连接酶直接将平末端的dn**段连接起来，或是用末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的dn**段加上poly（da）-poly（dt）尾巴之后，再用dna连接酶将它们连接起来；
三）先在dn**段末端加上化学合成的衔接物或接头，使之形成粘性末端之后，再用dna连接酶将它们连接起来。
这三种方法虽然互有差异，但共同的一点都是利用dna连接酶所具有的连接和封闭单链dna的功能。
7. 简述分子克隆中常用的工具酶及其作用。
限制性核酸内切酶的主要用途。
1）在分子克隆过程中切割dna以获取目的基因片段、切割载体形成切口，使目的基因能插入载体。
2）分析限制性片段长度多态性（rflp），用于遗传病的诊断，法医dna指纹分析等。
3）用于构建dna的物理图谱、基因定位及dna同源性分析等。
dna聚合酶。
1、dna聚合酶ⅰ和klenow片段：klenow片段的主要功能有：
1)补齐双链dna的3'末端，同时可使3'末端dna标记同位素；
2)在cdna克隆中，合成cdna第二链；
3)dna序列分析。
2、 taq dna聚合酶 taq dna聚合酶可用于dna测序及通过pcr对dna分子的特定序列进行体外扩增。
3、 逆转录酶依赖rna的dna聚合酶，它以rna为模板、4种dntp为底物，催化合成dna，其功能主要有：
1)逆转录作用；
2)核酸酶h的水解作用；
3)依赖dna的dna聚合酶作用。
4、 末端脱氧核糖核苷酰转移酶功能主要有：
1)在载体或目的基因 3'末端加上互补的同质多聚尾，形**工粘性末端，便于dna重组连接。
2)用于dna 3'末端的同位素探针标记 。
dna连接酶（dna ligase） 在dna重组中的主要功能是催化两个dna分子的5磷酸基团与3羟基形成3’,5’磷酸二酯键，将具有相同粘性末端或平末端的两条双链dn**段连接起来，实现dna的体外重组。
碱性磷酸酶：作用是催化除去dna、rna或dntp上的5'-磷酸基团，其主要用途有出去dn**段上的5'磷酸，以防自身连接。在使用t4多核苷酸激酶和32p同位素标记前出去rna或dna上端的5'磷酸。
核酸酶s1:可水解双链dna、rna或dna-rna杂交分子中的单链部分，其作用是出去双链dna的粘性末端以产生平末端、出去cdna合成时形成的发夹结构以及分析rna的颈环结构和dna-rna分子的杂交情况等。
8. 举例说明载体应具备的基本要素以及双抗生素筛选和蓝白斑筛选的原理。
1)载体应具有以下特征
能自我复制并具有较高的拷贝数，并有适宜的相对分子量，一般应<10kb;
带有遗传筛选标记；
有适当的限制酶切位点，便于外源基因的插入和筛选。
2）双抗生素筛选原理：某些质粒载体如 pbr322质粒中装有ampr和tetr 抗性基因，在含四环素和氨苄青霉素的平皿上都能够生长的细菌只含有空载体，此筛选方法称为双抗生素对照筛选。
3)blue/white screen: 蓝白斑筛选。即β-半乳糖苷酶基因失活筛选。
其原理是：某些质粒载体带有大肠杆菌乳糖操纵子的lacz’基因，该基因含一段编码β-半乳糖苷酶氨基末端145个氨基酸α－肽的dn**断，iptg可诱导此片断合成，此片断能与宿主细胞所编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内α－互补，形成完整的β－半乳糖苷酶。该酶能催化指使剂底物x－gal形成蓝色菌落。
当外源基因插入lacz’基因中mcs(多克隆位点)，lacα－肽基因阅读框架被破坏，细菌内将无β－半乳糖苷酶活性，结果重组克隆呈白色菌落。
9. 有哪些常用的探针标记物？如何进行探针的标记？
放射性同位素标记：常用标记探针的同位素：
32p：β，半衰期短（14.3d），标记核苷三磷酸，灵敏度很高，分辨率不高。
35s： β标记蛋氨酸或取代核苷酸α位磷酸基中的氧，灵敏度高，分辨率较高，核酸序列测定和原位杂交。
3h： β半衰期长（4417d），使用较少。
125i：γ，分辨率高，操作简单，安全防护要求较高，原位杂交。
同位素标记方法 1. 缺口平移法（双链） 2．随机引物法 （单链）
探针的末端标记 4．pcr标记dna探针
5．单向体外转录制备rna探针
非放射性标记。
1）.酶标记核酸探针辣根过氧化物酶（hrp）易进入细胞内部，便宜，易观察，应用最广泛。常用标记方法是戊二醛交联法和过碘酸钠法。
2）．生物素（biotin）标记核酸探针应用广泛，可替代同位素标记。用链亲和素系统检测。
酶促标记法操作复杂，**昂贵。光敏生物素（photobiotin）标记方法简单，**适宜。
地高辛（dig）：标记于dutp上，通过随机引物或缺口平移法引入dna分子中。可长期保存，不受组织、细胞中内源性生物素的干扰，敏感性高，检测产物反差好，背景染色低。
广泛应用于southern印迹杂交、斑点杂交、菌落杂交尤其是原位杂交。
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