实验4 革兰氏染色

实验四细菌的革兰氏染色形态观察，平板及斜面菌落观察。

一、目的要求。

学习并初步掌握细菌的革兰氏染色方法；

巩固革兰氏染色的原理及g-及g+细菌细胞壁结构的特点；

了解革兰氏染色在细菌分类鉴定上的重要性；

掌握细菌菌落与菌苔的主要特征。

二、实验原理。

革兰氏染色法是2023年由丹麦病理学家c．gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(g)和革兰氏阴性菌(g-)两大类，是细菌学上最常用的鉴别性染色法。

革兰氏染色法的主要步骤是先用结晶紫初染；再加媒染剂--碘液，以增加染料与细胞间的亲和力，使结晶紫和碘在细胞膜上形成分子量较大的复合物；然后用脱色剂(乙醇或丙酮)脱色；最后用蕃红复染。凡细菌不被脱色而保留初染剂的颜色(紫色)者为革兰氏阳性菌，如被脱色后又染上复染剂的颜色(红色)者为革兰氏阴性菌。

该染色法所以能将细菌分为g菌和g-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。g-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。g菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。

三、实验器材。

1、菌种牛肉膏琼脂斜面28℃培养24h的大肠杆菌(escherichia coli)斜面菌种，牛肉膏琼脂斜面28℃培养16h的枯草杆菌(bacillus subtilis)斜面菌种；

2、仪器显微镜；

3、材料载玻片，香柏油，二甲苯，擦镜纸，吸水纸，染色缸等。

4、染料草酸铵结晶紫染色液，路哥氏(lugol)碘液，95%乙醇，0.5%番红染色液。

四、操作步骤。

1、涂片在一张载玻片上加两滴蒸馏水后，分别涂布枯草芽孢杆菌和大肠杆菌(注意涂片切不可过于浓厚)。

2、固定将制成的涂片干燥固定，固定时通过火焰1-2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。

3、染色。初染将玻片置于玻片搁架上，加草酸铵结晶紫染色液(加量以盖满菌膜为度)，染色1-2min。倾去染色液，用自来水小心地冲洗。

媒染滴加(lugol)碘液，染1-2min，水洗。

脱色滴加95%乙醇，脱色20-25s立即水洗，以终止脱色。

复染滴加蕃红，染色2-3min，水洗。最后用吸水纸轻轻吸干。

4、镜检干燥后，置油镜观察。被染成紫色者即为革兰氏阳性菌(g)；被染成红色者是革兰氏阴性菌(g-)。

五、注意事项。

1、革兰氏染色成败的关键是脱色时间。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被认为是革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄、脱色时玻片晃动的快慢及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。

一般可用已知革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌作练习，以掌握脱色时间。当要确证一个未知菌的革兰氏反应时，应同时做一张已知革兰氏阳性菌和阴性菌的混合涂片，以资对照。

2、染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。

3、选用培养16-24h菌龄的细菌为宜。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。

六、作业。1、在你所作的革兰氏染色制片中，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌各染成何色？它们是革兰氏阴性菌还是革兰氏阳性菌？绘出所进行的革兰氏染色的细菌的形态图。

2、作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？其染色成败的关键是什么？

3、当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠？

4、试述细菌菌落的主要特征？同各菌的菌落与菌苔有何区别？

第四周微生物实验：细菌的革兰氏染色。

实验准备要求：

1、菌种大肠杆菌、枯草杆菌及葡萄球菌，在牛肉膏琼脂斜面28℃-30℃培养20-24h的新鲜斜面培养物；

2、仪器显微镜；

3、材料显微镜，接种环，酒精灯与灯用酒精，火柴，载玻片与盖玻片，洗瓶与蒸馏水，废液缸，擦镜纸与吸水纸，香柏油，二甲苯；

4、染料草酸铵结晶紫染色液，路哥氏(lugol)碘液，95%乙醇，0.5%番红染色液。

张镜 2004-9-15

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