二、研究方案。
一）试验方案。
研究一玉米根系、叶片蛋白质组双向电泳技术体系的建立与优化。
1、 研究目的。
通过采用不同蛋白裂解液配方进行玉米根系、叶片的双向电泳，比较各种方法跑胶的效果，选择最佳的提取方法，建立符合该组织和系统的双向电泳技术体系。
2、 研究内容。
3、 试验方案。
1）、供试材料：耐淹型浚单20（xd20）或敏感型登海662（dh662）
2）、试验设计：随机区组试验设计，4次重复。在人工气候室进行培养，正常条件下培养，在两叶一心期取其根系、叶片，置于-80c下保存，备用。
3）、取样：取样时，将根系在流水下清洗干净后，将整个根系和叶片取下，备用，如不立即使用，置于-80c保存。提取时，将所取根系、叶片分别混合，液氮研磨后平均分为三份。
4）、操作方法：
蛋白质的提取方法。
a、tca-丙酮沉淀法法(tca／acetone extraction)
参考damerval的方法，略作改动。
1) 使用之前将一份丙酮在-20c下放置至少15分钟；每份样本大约需2ml丙酮，确认样本管是采用丙酮耐受材料制成；
2) 精确测量每份样本的体积，将每份样本分装入2个离心管中，每个管中4倍样本体积的预冷丙酮（含10%三氯乙酸，和0.1%dtt）；
3) 在-20c下沉淀蛋白质至少2小时；
4) 在2-8c下以大约13000xg的离心力（小型微离心设备，13000rmp）将蛋白质离心10分钟（将离心管按照公认位置置于离心设备中，盖冲外，有利于检测小蛋白质沉淀）；
5) 轻轻倒出丙酮，不要搅散离心沉淀，可采用干净的吸水纸小心将丙酮液滴从沉淀上吸去；
6) 风干沉淀（一般在室温下5-10分钟），不要过度干燥（注意如果过度干燥，再溶解就会很困难）；
7) 用合适的缓冲液将沉淀样本再溶解；
8) 如果不立即使用，可储存于-20c或-70c条件下。
b酚提取法(tca／acetone／phenol extraction)
1）、取新鲜玉米组织2 g，液氮中迅速研磨成细粉；
2）、加入1.5倍苯酚和1.5倍的苯酚提取液，5000rpm离心10min，收集上清液；
3）、再加入1倍体积的酚提取液，再次5000rpm离心10min，收集上清液；
4）、加入0.2倍体积的甲醇，-70c冰箱保存过夜；
5）、离心、清洗沉淀，用200μl的甲醇缓冲液（内含0.1m nh4ac，1%β-me）,离心去上清液；
6）、重复上述5步骤，往沉淀中加入80%丙酮200μl，离心沉淀保存在-4c中待用。
c聚乙二醇沉淀法（备用，不做详细介绍）
1）、精确测量每份样本的体积，将每份样本分装入2个离心管中，取100～150ml 50% peg溶液加入到100ml蛋白样品中，缓慢搅拌60min，至完全沉淀，然后离心收集蛋白质沉淀。
2）、风干沉淀（一般在室温下5-10分钟），不要过度干燥（注意如果过度干燥，再溶解就会很困难）。
裂解液配方：
a、8m尿素（可增至9m或9.8m），1%（m/v）dtt，2%～4%（m/v）chaps，2%（v/v）两性电解质（ph3～10）,10m pefabloc蛋白酶抑制剂。
b、7m尿素，2m硫脲，1%（m/v）dtt，2%～4%（m/v）chaps,2%(v/v)两性电解质（ph3～10），10m pefabloc蛋白酶抑制剂。
根系蛋白质提取方法：
1) tca-丙酮沉淀法与配方a
2) 苯酚提取法与配方a
3) tca-丙酮沉淀法与配方a
4) 苯酚提取法与配方a
5) 聚乙二醇沉淀法与配方a
叶片蛋白质提取方法：
1）、tca-丙酮沉淀法与配方a
2）、tca-丙酮沉淀法与配方b
3）、苯酚提取法与配方a
蛋白质浓度测定。
蛋白质浓度测定采用bradford法，1）、试剂：
标准蛋白质溶液，用 g—球蛋白或牛血清清蛋白(bsa)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。
考马斯亮兰g—250染料试剂：称100mg考马斯亮兰g—250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。
2）、器材：
可见光分光光度计。
旋涡混合器。
试管16支。
操作方法。1）、标准方法。
取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入.1ml，然后用无离子水补充到0.
1ml。最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰g—250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。
未知样品的加样量见下表中的第管。
加完试剂2-5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值a595，空白对照为第1号试管，即0.1mlh2o加5.0mlg—250试剂。
注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。
3）、用标准蛋白质量（mg）为横座标，用吸光度值a595为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的a595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。
0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的a595约为0.50。
第一向等电聚焦。
1）、 从冰箱中取-20℃冷冻保存的水化上样缓冲液（不含dtt，不含bio-lyte）一小管（1ml/管），置室温溶解；
2）、 在小管中加入0.01g dtt， bio-lyte-7各2.5ml，充分混匀；
3）、从小管中取出400ml水化上样缓冲液，加入100ml样品，充分混匀；
4）、从冰箱中取-20℃冷冻保存的ipg预制胶条（17cm ph 4-7），室温中放置10分钟；
5）、沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。注意：不要产生气泡。否则影响到胶条中蛋白质的分布；
6）、当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后，用镊子轻轻的去除预制ipg胶条上的保护层；
7）、分清胶条的正负极，轻轻地将ipg胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上，使得胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极。确保胶条与电极紧密接触。不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上，因为这些溶液不会被胶条吸收。
同样还要注意不使胶条下面的溶液产生气泡。如果已经产生气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶到胶条以外；
8）、在每根胶条上覆盖2-3ml矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上；
9）、对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序。
平衡。聚焦结束的胶条应立即进行平衡、第二向sds-page电泳，否则将胶条置于样品水化盘中，-20℃冰箱保存，ipg胶条需要平衡两次，每次15min。
1）、每10ml平衡缓冲液中加入0.1g dtt,平分装于两支玻璃管中（相当于平衡缓冲液ⅰ），等电聚焦后，取出ipg胶条分别放入不同标号的玻璃管中（一支玻璃管只能放入一条ipg胶条），用封口膜封口，缓慢**15min,倒掉平衡缓冲液ⅰ；
2）、每10ml平衡缓冲液中加入0.4g碘乙酰胺，平分装于两支玻璃管中（相当于平衡缓冲液ⅱ），方法同第一次平衡；
3）、用ddh2o润洗ipg1秒钟，将胶条的边缘（垂直、弯放）置于湿润的滤纸上几分钟以除去多余的平衡缓冲液。
第二向sds电泳。
1）、装好灌胶模具，倒入凝胶溶液，在每块胶上加入覆盖液以得到平的凝胶上样平面；
2）、灌胶之后立即在每块凝胶上铺上一层水饱和的正丁醇或异丁醇，以减少凝胶暴露与氧气，形成平展的凝胶面；
3）、凝胶聚合后，倒掉覆盖在凝胶上的正丁醇溶液，并用凝胶储存液冲洗凝胶表面；
4）、暂时不需要的凝胶可用塑料薄膜包好于4℃保存1-2天；将整个凝胶模具完全浸没在凝胶储存液中可4℃保存1-2周；
5）、电泳槽中装满电泳缓冲液，并打开温控系统，调节温度为15℃；
6）、将平衡好的ipg胶条小心放置于sds胶面上，并轻压使ipg胶条与sds脚面充分结合，上面覆盖2ml热的琼脂糖溶液（75℃），使琼脂糖在5min内凝固。其余的ipg胶条重复上述操作；
7）、将胶盒插入电泳槽中，开始电泳。采用垂直式sds胶电泳；
8）、当溴酚蓝燃料迁移到胶的底部边缘即可结束电泳；
9）、泡好的胶转移到染色盒里固定，准备染色。
染色（考马斯亮蓝染色）
1）、固定 20% tca1h
2）、染色 0.1%cbb in 40% eton/10% acetic acid 2h
3）、脱色 1% acetic acid2x30min
4）、强化 1% acetic acidovernight
5）、清洗 deionized h2o30 min
凝胶的图像处理分析和胶内酶切。
双向凝胶电泳分析及多肽点的质谱鉴定。
4、 拟发表文章写作提纲。
材料与方法：
结果与分析。
1）、不同方法对玉米根系蛋白2-de图谱的影响。
不同提取方法；
不同裂解液；
不同上样量。
2）不同方法对玉米叶片蛋白2-de图谱的影响。
不同提取方法；
不同裂解液；
不同上样量。
一、试验设计与处理。
一）、不同基因型玉米不同组织淹水响应的差异蛋白质表达。
1、试验材料与方法。
本实验采用盆栽方式，将耕层土壤过筛，混匀后装盆并施入底肥。供试样品为：耐淹型品种浚单20（xd20），敏感型品种登海662（dh662）。
在两叶一心期将其全部置于水中，并保持水层高于土壤表面2.5cm，对照正常供水。设5个处理：
淹水天。每个处理均设对照，重复4次。在试验处理期间，定期加水以保持水面，其他栽培管理同生产。
每个品种种36盆，两个品种共72盆。
二）、淹水时期和持续时间对不同基因型玉米蛋白表达的影响。
1、试验设计：
采取裂区设计，主区为品种，副区设置4种处理方式，每个处理4次重复。
供试品种：耐淹型品种浚单20（xd20），敏感型品种登海662（dh662）
处理1：对照。
处理2：淹水1天。
处理3：淹水3天。
处理4：淹水5天。
分别在3个生育期进行淹水处理：苗期（出苗后10天开始处理）、穗期（小喇叭口开始处理）、花粒期（吐丝后30天）
施肥管理：一次性施足底肥，玉米生育期较长，会不同程度上造成玉米后期脱肥，影响产量；另外一次性施入底肥，用量大，易烧苗，，会给玉米一播全苗造成影响，所以应玉米底肥和追肥相结合。一般每亩施用优质复合肥20～25kg。
在玉米生长期长期追施尿素20kg，这样施肥既能保证田间玉米的正常施肥：n：p：
k=25:10:18,4500株/亩。
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