近10年来,以表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,egfr)作为ie点所代表的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,nsclc)个体化**,取得了极大的成功,egfr突变的晚期nsclc接受egfr tki**,中位总生存时间已达2430个月。目前的研究热点在于如何克服 egfr靶向**的耐药。egfr-tki耐药机制包括:
20外显子t790m突变、原癌基因met扩增和过表达等。本文就 egfr突变nsclc中原发和继发性c-met信号通路改变所引起的耐药研究进展进行综述。
的结构。c-met是一类具有自主磷酸化活性的跨膜受体,属于酪氨酸激酶受体(receptor tyrosine kinases,rtks)超家族成员。 编码该受体的基因位于7号染色体q21-31区,大小约llokb, 包括21个外显子。
c-met受体由50kd的a链和145kd的 p 链组成的异二聚体,包括 sema(semaphorins),psi(plexins, semaphorins,integrins), 4 ipt 重复区域(immunoglobulins,plexins, transcription factors),tm (transmembrane), jm (juxtamembrane), 和tk (tyrosine kinase)保守蛋白区域。胞外氨基末端500个残基折叠成一个大的senrn区域,为与配体结合及受体二聚化所必需的重要结构。psi区域紧接在serrm区域后面,大约有 50个残基和4个二硫键,这个区域通过四个ipt区连接到跨膜螺旋。
在细胞内,c-met受体包含一个酪氨酸激酶催化域,有4个关键的调节酶活性的酪氨酸残基,形成几个信号传导蛋白的停泊位点,进而导致生物应答。c-met最先是从人骨肉瘤衍生出的细胞系中分离出来的,随后发现主要是在上皮细胞上表达。在胚胎发育和成年时期,很多器官上皮细胞表面表达c-met受体,包括肝、胰腺、前列腺、肾脏、肌肉和骨髓。
hgf是c-met的唯一配体,最先作为促进肝细胞**的物质被发现,随后证实其和分散因子是同一种物质(scatter factor,sf),可以诱导上皮细胞**。hgf主要**于间质细胞,以旁分泌的形式作用于表达c-met受体的上皮细胞。 编码hgf的基因位于7号染色体q21区,大小约70kb,包括18个外显子和17个内含子。
hgf前体是由间质细胞分泌,由728个氨基酸残基组成的单链,在蛋白水解酶的作用下产生活性形式,成熟的hgf是由96kda的a链和34kda的p 链经二硫键连接组成的异二聚体。hgf含6个结构域,分别为氨基末端结构域、4个kringle结构域及sph结构域(serine proteinase homology,sph)。hgf/c-met 具有多种生物学功能,可以促进细胞增殖、生长、运动、分散、分化和形态发生。
信号通路。当c-met与其配体hgf结合后,触发受体二聚化和转移磷酸基,胞质中酪氨酸残基(tyrl234、tyr1235)可发生自身磷酸化,从而激活c-met胞质内蛋白激酶结构域中酪氨酸激酶 (phosphotyrosine kinase,ptk),激活的 ptk 可引起 c-met 竣基末端酪氨酸(tyrl349、tyrl356)的自身磷酸化。c-met激活招募衔接蛋白gabl和grb2、激活shp2、ras和erk/mapk, 细胞质中的多种效应蛋白募集到磷酸化的羧基末端并被快速磷酸化,最后激活细胞内多种信号通路,如phosphoinositide 3-3-kinase (pi3k)/akt、ras-rac/rho、mitogen-activated protein kinase (mapk)及stat3通路等,促进细胞变形、增殖、抗凋亡、细胞分离、运动和侵袭。
正常的hgf/c-met信号通路在不同细胞、不同分化阶段参与多种生理过程,如胚胎发育过程中控制细胞的迁移,组织损伤后的修复等。c-met表达的异常调节有过表达、组成的激酶激活、基因扩增、通过hgf旁分泌和自分泌激活、c-met突变以及后继的改变。虽然在大部分肿瘤中c-met扩增的发生率一般较低(<1%),但是nsclc的发生率可达2%4%,c-met基因扩增,导致蛋白过表达和激酶激活。
到目前为止, hgf/c-met通路最常见的失调机制是过表达,可通过c-met 基因扩增或者通过扩增依赖性途径提高c-met表达水平。 c-met过表达的肿瘤中,c-met可以不依赖hgf被激活。异常的hgf/c-met信号通路在肿瘤发生发展中起非常重要作用,能诱导肿瘤的生长、侵袭和存活。
信号通路的异常。
3.1 c-mer 突变。
c-met突变激活激酶或者使激酶对刺激髙度反应,改变活化程度或者蛋白有效降解,进而延长生物化学信号的持续时间。突变可以发生在胞外和胞浆区域。在遗传性乳头状肾癌中第一次发现c-met激酶区突变。
对肺癌和其他实体瘤外显子的系统性分析显示cmer突变主要发生在 sema和jm区域。
sema区域突变。
c-met的胞外sema区由外显子2编码,为hgf结合提供特定的位点。突变分析显示该区域是受体激活和二聚化所必需的。7%胸膜间皮瘤发生该区域突变(n375s、m431v和 n454i),但是这些突变在细胞恶性转化中的作用仍不详。
研究报道肺癌sema区域种系存在突变,例如,在亚裔和高加索肺癌患者中检测到n375s突变,但是在非裔美国肺癌患者中没有发现该突变。在肺癌,n375s更常见于鳞癌而非腺癌或大细胞癌。sema区域突变导致c-met与hgf亲和力不同,体外研究显示n375s突变可能导致对met抑制剂耐药。
jm区域突变。
jm区域具有特征的功能获得性突变是受体酪氨酸激酶 flt3。flt3出现在大约20%急性髓性白血病患者中,可以调节flt3激酶的催化活性。在急性髓性白血病中发现 c-met的jm区域t992i突变,尽管急性髓性白血病的发生通常与jm区域c-met突变可能无关。
jm区域c-met突变的rottweiler狗发生癌症的风险增加。74% rottweiler狗携带功能获得的met g966s种系突变,更容易发生淋巴瘤、骨肉瘤和组织细胞肉瘤等恶性肿瘤。一些jm区域突变加快人恶性肿瘤的形成而不是完全转化为恶性肿瘤。
例如c-met- t992i突变和met激酶激活不完全相关,然而,无胸腺的裸鼠接种表达c-met-t992i的nih3t3细胞系比c-met野生型细胞系更快发生恶性肿瘤。除了 t992i突变外,在126例肺腺癌患者中发现r970c和t992a种系突变,可能与肺癌发生有关。sclc组织样本和细胞系的突变分析显示jm区域发生r970c,t992i和s1040p突变。
r970c突变出现在非裔美国人和高加索肺癌患者中,但罕见于非亚裔患者。体外实验显示这些改变促进肺癌发生、细胞迁移和c-met蛋白磷酸化。活性氧(reactive oxygen species,ross)水平增加可能和r970c和t992i改变相关。
很多肿瘤细胞中r0s**于线粒体,传导癌症信号通路,促进基因组不稳定。
激酶区域突变。
c-met激酶区域活化是信号传导和生物应答所必需的。c-met激酶区域突变并不常见,并且大部分c-met激酶区域的激活突变发生在散发的乳头状肾癌(体细胞)和遗传性乳头状肾癌(种系)中。这些突变导致c-met激酶活性增加,促进细胞运动和肿瘤转移。
尽管很多研究致力于发现编码 c-met基因所有外显子的其他突变,但是可以推测小分子酪氨酸激酶抑制剂如bcr-abl和其他激酶诱导**的使用可能导致c-met激酶区域的再次突变。
3.2 c-met基因扩增。
c-met基因扩增可以激活c-met受体。10%~20%人胃癌细胞中检测到c-met基因扩增,1'扩增显示出对 met抑制剂**敏感。
断裂-融合-桥接(breakage-fusion-bridge,bfb)机制被认为是导致c-met基因扩增的主要原因[3。在nsclc中, c-met基因扩增和paxillin表达显着相关,而paxillin是一种局灶吸附蛋白参与细胞骨架功能的调节。因为c-met基因扩增使得细胞出现恶性转化,可以想象c-met基因扩增可能导致其他癌基因转化的肿瘤出现**耐药。
研究证实c-met 基因扩增是egfr突变肺癌对egfr小分子抑制剂耐药的机制。
3.3 c-met蛋白过表达。
c-met过表达可以导致肿瘤形成。升高的c-met蛋白水平和c-met信号通路的功能激活可以转化正常成骨细胞。 体外研究发现,c-met过表达导致人成骨细胞转化为骨肉瘤细胞,体内产生骨肉瘤样疾病。
肝细胞过表达c-met可以诱导转基因鼠发生肝细胞肝癌。ichimura等研究发现 c-met过表达出现在38.5% (20/52)鳞癌,72.
3% (34/47)腺癌以及研究的全部11种nsclc细胞系中。与邻近正常肺组织相比,nsclc中c-met蛋白表达水平通常升高2-10倍, hgf水平升高10-100倍。许多蛋白质和c-met蛋白表达相关,在神经内分泌肿瘤中,下游靶点paxillin和转录因子 pax5与c-met和/或磷酸化c-met共同表达。
在肺癌易感性和肿瘤发展中,并不需要hgf和c-met同时表达异常。hgf转录调节了解得很少,但是已经发现增加c-met表达的几个关键因素,例如缺氧可以诱导c-met表达,并且增加依赖hgf的侵袭性在结直肠癌中,c-met表达上调可能是wnt信号通路调控的早期事件气转录激活因子的pax家族成员是调节c-met蛋白表达的重要因子。在肢体肌肉发育过程中,pax3和pax7通过独特的机制调节c-met表达。
在肺癌,pax5表达于sclc,而pax8表达于nsclc在 sclc中,pax5是c-met的转录因子,并且在细胞核中发现激活的c-met。可能有组织和谱系特异的其他因子调节 c-met表达。
检测c-met蛋白表达的方法是免疫组织化学染色 (immunohistochemistry,ihc)。随着使用ihc染色的强度标准不同,文献报道的met表达率不同。一种ihc染色的方法分为0-3。
根据染色阳性的肿瘤细胞百分比,染色程度计分 0~100%,最终得分是这两种计分的和。肿瘤组织最终计分认为是阴性,得分》3认为是阳性。sun等报道在非选择性的 nsclc (n=183)中,c-met 阳性率为 67.
2% [43]。huang 使用h-score系统染色计分方法半定量分析c-met免疫反应性。染色强度得分和之前的文献描述相同,但是每个强度阳性百分比用百分率计算。
h-score是强度得分和得分百分率的乘积,得分范围0~300。结果显示nsclc (n=120)中,c-met 过表达的发生率为51%。目前还有一种新药ras抑制剂安卓健也是针对肺癌的**,目前正处於二期临床阶段,相信在不久的将来,安卓健会造福肺癌患者。
4. c-met 与 egfr-tki 耐药。
egfr-tkis巳经成为egfr突变的nsclc患者一线标准**,延长了患者无进展生存期(ptogression-free-survival, pfs), 改善了患者生活质量。但几乎所有的egfr突变患者最终会对egfr-tkis**产生获得性耐药。
4.1 c-met与egfr-tki获得性耐药。
egfr-tkis获得性耐药的主要机制有egfr-t790m突变、c-met基因扩增或者表达,其中c-met基因扩增占5%~ 22%。 engelman等认为,egfr突变型肺癌细胞依赖于其自身激活的、通过erbb3介导的pi3k/akt信号通路而增殖并成瘾;gefitinib诱导的细胞凋亡通过下调该通路而实现。该研究组构建了一株开始对gefitinib敏感但暴露在递增浓度的gefitinib 6个月后产生了耐药克隆的细胞株。
他们发现这一耐药归因于c-met原癌基因的扩增,对c-met通路的抑制可恢复其对gefitinib的敏感性;同样,c-met扩增导致的 gefitinib耐药通过以erbb3介导的pi3k的持续激活,从而绕过了 gefitinib作用的靶点egfr。为了确认相关发现的临床意义,他们进一步分析了18例gefitinib /erlotinib获得性耐药患者的肿瘤标本,22%(4 /18)的患者检出c-met扩增。在获取服药前后配对肿瘤标本的8个病人中,2例患者**前并不存在的c-met扩增在,但出现在gefitinib /erlotinib获得性耐药之后。
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