肖琦 00511103
今年暑假我在圣路易斯华盛顿大学的实习可以说是终身难忘的经历。我在医学院神经与解剖系paul taghert教授的实验室实习了两个多月。主要的工作与果蝇肽能神经元的发育有关。
我的工作是围绕一个新近发现的与果蝇肽能神经元发育有关的基因dimm进行的。dimm是于2023年由taghert教授实验室发现的。dimm缺陷型的果蝇神经系统显著丧失或减弱了众多肽能神经元特有的标记，如神经肽dfmrfa的染色以及神经肽修饰酶phm的水平，提示dimm在果蝇肽能神经元的发育中可能有重要作用。
dimm基因具有碱性螺旋-环-螺旋结构，说明dimm可能是作为转录调控因子来在果蝇神经系统发育中发挥作用的。然而进一步的研究表明dimm的功能并不单一，大致可以分为三种情况：第一种情况是dimm可以独立发挥作用来控制phm的表达；第二种情况是dimm与其它已知的发育调控因子apterous、squeeze等一起调控神经肽dfmrfa、flurin1等的表达；此外dimm还与神经元内囊泡的形成有关。
针对dimm功能的第一种情况，即dimm可以独立调控phm的表达，由于dimm是具有碱性螺旋-环-螺旋结构的转录调控因子，很容易设想phm基因可能是dimm转录因子的直接靶点。而2023年taghert实验室发表的文章证实了这一点：dimm通过激活phm第一个内含子的三个e-box区来调控phm表达。
而面对dimm的功能如此丰富多样，我们不禁要问——除了phm dimm还没有其他的靶点呢？
我的工作就是帮助寻找dimm的新靶点。在我的暑期实习开始之前，taghert教授实验室已经通过microarray等一系列手段确定了13个可能的目标基因。而我的工作计划就是通过原位杂交的手法定位这13个基因在中枢神经系统中得分布以找寻可能的靶基因。
这样做的原因是基于dimm与phm享有很相似的表达形式，那么通过定位这13个基因并与dimm在中枢神经系统中的表达形式相比较，就有机会帮助发现dimm的可能靶点。
我采用的是技术是酪胺信号放大系统荧光原位杂交技术。这是在传统原位杂交技术的基础上又引入了酪胺信号放大系统以提高监测的灵敏度和信号强度。由于待检测的13个基因表达水平并不是很高，引入这项技术提高原位杂交的灵敏度是很重要的。
由于taghert教授实验室此前并未进行过引入酪胺信号放大系统的原位杂交技术，因此我这两个月的实验主要是在建立这项技术的实验条件以得到高质量的原位杂交结果。因为phm基因以被证实是dimm的靶基因，且有其它实验室在近期成功得到了phm基因的原位杂交图，所以我一直在利用phm基因作为阳性对照建立实验条件。然而结果一直不是很理想，始终存在背景较深而实际信号不强的问题，因此我尝试改变了不同的实验条件，调整在原位杂交中比较重要的几个关键点来试图改善这一问题。
诸如探针的制备、杂交的温度和时间、抗体的处理等步骤我都一一做了不同条件梯度加以测试，以期找到最佳的实验条件。然而直到我的实习结束时，我仍没有得到很好的实验结果。在预期存在phm表达的区域如环腺cc细胞、大脑半球pc细胞等处可观察到一些信号，但对照组较强的背景让我们难以下确切地结论。
在我最后离开之前与实验室人员的讨论中，我们发现我们使用的探针大小与已经成功得到phm原位杂交结果的实验室不同，而其它实验步骤一样，这可能是影响结果的一个关键。如果还有时间的话，我会尝试对探针进行水解，使其变为更小的片断而更容易进入细胞及杂交。
另外还有在实习过程中对科研和美国学术氛围的一点感想。首先这两个月的工作在一位博士后的指导下对如何涉及实验、如何思考实验问题有了一个比较比较清晰的了解。以前在实验遇到困难和瓶颈时往往无从下手，现在的我应该更会冷静思考，小心排除干扰因素。
其次，对未来从事科研道路更加坚定了信念。一方面是由于自己本身的兴趣，但同时另一方面我觉得也和在美国博士生和博士后比国内的待遇好很多有关。这是实话，因为我认为只有在生活***的前提下人才能专心于科研，而这方面国内确实是还有一定差距的。
同时国外的生物产业也发达很多，不仅提供了很方便的产品与服务也提供了很大的就业机会。对于学术氛围，虽然国外的实验室研究总体水平可能会比我们高，但我不认为我们对学术的**氛围比他们差，我们的学生可能更需要提高的是学术写作和表达的能力。
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