2023年秋季《分子生物学》课程的实验安排。
09级植保1,2班；09级植保安检方向1,2班 ）
实验一转prsv复制酶基因的番木瓜总dna的抽提。
及目的基因的pcr检测
实验目的：练习dna的抽提及pcr的实验过程，熟悉琼脂糖凝胶电泳的相关操作。
实验内容。a 转基因番木瓜总dna的抽提。
实验材料：转prsv复制酶基因片断的番木瓜植株幼叶。
实验步骤 1． 取若干2%ctab抽提缓冲液 (2%ctab，1.4mol/l nacl，20mmol/l edta，100mmol/l tris-hcl，ph8.0，用前加0.
2%的巯基乙醇)在65℃水浴中预热。
2． 取供试番木瓜植株幼叶0.2克，置于研钵中加液氮研磨成粉状。
3． 在液氮挥发将尽而植物组织尚未解冻时迅即加入600μl 预热的抽提缓冲液，稍作研磨混匀。
4． 研磨液转入1.5ml离心管中，65℃水浴30分钟，期间不时摇匀。
5． 加入300μl tris-饱和酚，300μl氯仿/异戊醇(24：1)，剧烈振荡2~3分钟，12, 000rpm，10分钟离心(室温)，取上清液置于新的离心管中，记下所取的体积数。
6． 加入等体积氯仿/异戊醇(24：1)，温和地混匀，12,000rpm，10分钟离心(室温) ，取上清液置于新的离心管中，记下所取的体积数。
7． 加入1/10体积的3mol/l naac (ph 5.2) 和2倍体积冰冻的无水乙醇，混匀，置-20℃冰箱20分钟。
8． 4℃下12,000rpm，10分钟离心，弃上清液。沉淀分别用冰冻的70%乙醇和无水乙醇各洗一次，室温下风干，溶于200μl te (1mmol/l edta，10mmol/l tris-hcl，ph8.0)中(用手指轻弹离心管使沉淀充分悬浮)。
此溶液即为dna粗提取液，可进行特异引物pcr等后续研究。但该制品中仍含有较多的杂质，尤其含较多的rna。可进一步做精提纯。)
b dna特异引物pcr
pcr热循环参数：
c pcr产物的琼脂糖凝胶电泳观察。
制胶过程：5×tbe缓冲液稀释10倍，配制成0.5×tbe工作液待用。
称1.0g琼脂糖粉，置于200ml锥形瓶，加100ml 0.5×tbe稀释缓冲液、5μl eb替代物。
用微波炉 (或电炉)加热至琼脂糖全部熔化。
将装好的胶槽置于水平支持物上，插上样品梳子。
将冷却至60℃左右的胶液缓缓倒入胶槽中（注意不要产生气泡），胶的厚度约4~6mm
待胶完全凝固后拨出梳子（注意不要损伤梳底部的凝胶）↓
将胶槽置入电泳槽中，向槽内加入0.5×tbe至液面恰好没过胶板上表面。
点样及pcr运行：
加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源（控制电压保持在70v）
上样到开始电泳的时间不宜过长， 因为先上的样品中dna会发生扩散，
从而影响电泳效果)
当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时（约需30分钟），关闭电源，停止电泳。
剑飞同学：收到你班的毒力测定实验数据了，现将修改后用于做实验报告数据发还给大家（见附件），同时将毒力测定中要注意的事项跟大家说说，麻烦**给同学们：
1、毒力测定往往用原药来做（由“毒力”的概念可以理解，即“药剂本身”），通常用有机溶剂溶解原药后配成一系列浓度来供试，相应的有机溶剂作对照；而制剂因为除原药外还有其它原料，所以一般不拿来做毒力测定用。2、毒力测定的结果要符合一定的要求：首先对照组的死亡率不能超过20%，如果超过20%，可能是试虫的状态不好，实验结果不可用；其次如果用统计分析软件处理数据，求出毒力回归方程的同时会得出一个相关系数r，相关系数必须大于或等于0.
9，也就是说药剂浓度与试虫的死亡率成一定的相关性。3、实验结果如果对照组的死亡率小于5%，那么处理组的死亡率可以不经校正；如果在5%至200%之间，那么必须校正。4、毒力测定每个处理须设定3个以上重复，你们班10个组当作10个重复。
5、点滴由低浓度往高浓度点滴，期间无须清洗点滴器。
希望你们在做毕业**的过程中，多向师兄师姐们学习统计分析软件的使用方法，可以快速准确地得出实验结果。作图法往往误差比较大。
祝大家学业顺利！
翁群芳。
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