动物育种学实习安排。
第一天：讲授实习要求及具体实验方法步骤，熟悉仪器设备的使用；同学们准备实验物品并灭菌备用。
分6组进行实验。
第二天：提组织中dna并检测、pcr；对pcr结果进行检测，看是否有所需片段，若有进行酶切并pcr，检测结果并报告。
第三天：分组汇报实验结果和某一家畜品种的起源、驯化、特点和利用内容。完成实习报告（字数1500，有电泳**结果可打印剪切贴上，但报告必须用稿纸手写）。
实习内容分子生物学技术在家畜育种中应用。
一、目的要求
了解分子生物学技术在家畜生产中应用，并初步掌握氟烷（hal）基因检测的原理和方法。
二、实习性质
综合应用 三、内容与方法
猪的ryr1基因（ryanodine receptor 1, ryr1，兰尼啶受体基因），又称骨骼肌释放通道基因（caleium release channel, crc），其突变是导致猪应激综合症的主要原因，可作为氟烷基因的候选基因。ryr1基因位于6号染色体，通过对ryr1基因的dna序列分析表明，氟烷阳性猪和阴性猪在第1843处发生c→t颠换，该位点的突变能够引起限制型内切酶识别位点的改变。利用 pcr-rflp即可鉴别出个体所携带的基因型。
常用于pcr-rflp分析的dn**段约有700bp，其两端引物分别为：
ryr1 1:5’-tcc agt ttg cca cag gtc gta cca-3’
esr2 2:5’-att cac cgg agt tta gtc tct gag-3’
1、dna提取。
组织dna提取：参照dp1201细胞/组织dna提取试剂盒操作步骤（附1）。
2、pcr扩增
（1）用微量移液器按表1，向200ul eppendorf离心管中依次加入：dna模板、引物、dntp、10×缓冲液、mgcl2、dna聚合酶、ddh2o，混匀后，离心使反应成分集于管底；注：可同时扩增多管，先**一起混合后再分装至各管，以减少加样误差。
表1：pcr反应加样量。
（2）打开pcr仪，设置好下列反应程序：94℃，5min；92℃，45sec；59℃，45sec；72℃，45sec；30个循环；72℃，10min；4℃保存。
（3）将离心管置于加样板内，盖上pcr仪盖子；
（4）启动pcr，开始进行反应。反应结束后取出eppendorf离心管。
3、pcr扩增产物检测
（1）制备1.4%加有eb溴化乙锭的琼脂糖凝胶；
（2）用微量移液器吸取5ul pcr扩增产物，加入1ul上样缓冲液并混合；
（3）将混合液加入琼脂糖凝胶加样孔中，同时在另一泳道100bp ladder作为标记对照物；
（4）电泳完毕，将凝胶置于紫外投射仪下观测，结合100bp ladder谱带，判定是否有目的pcr扩增产物。
4、ryr1基因pcr-hhaⅰ酶切
（1）用微量移液器取10ul pcr产物置于1.5ml eppendorf离心管中，而后加入0.5ul（10u/ul）hhaⅰ内切酶，2ul buffer，7.5ul双蒸水；
（2）用封口膜封好离心管，37℃消化过夜（5-12h）；
（3）酶切产物检测同上。
5、 pcr-rflp分析。
pcr 产物经内切酶 hhai 酶切后，基因未发生突变时，内切酶hhai可将pcr扩增的特异片段酶切成 493 bp和166 bp两条带，则可判定基因型为nn。当氟烷基因两个位点都发生突变（c1843→t1843）时，hhai限制内切酶识别位点消失，659 bp扩增的片段不能被酶切消化，电泳后只有一条带，基因型为 nn。当一个氟烷等位基因发生突变（c1843→t1843），而另一个正常，用hhai酶切可以观察到659 bp、493 bp和166 bp 3条带，其基因型为nn。
四、实习报告
1、pcr-rflp基因型如何准确判定？
2、现代育种方法应用于动物育种中的实例？
分组汇报实验结果（围绕实验室整个实验和问题进行）和某一家畜品种的起源、驯化、特点和利用内容。完成实习报告（字数1500，有电泳**结果可打印剪切贴上，但报告必须用稿纸手写）。
附1：组织dna提取注意事项及操作步骤。
注意事项（实验前必须首先阅读此部分！）
1． 所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13，000 rpm的传统台式离心机。
2．用户需自备异丙醇、70％乙醇、pbs(用于细胞)、液氮研钵/或匀浆器(用于组织.5mol edta和蛋白酶k(用于鼠尾)、水浴箱。
3．开始实验前将需要的水浴先预热好备用。
操作步骤。1．动植物组织（例如鼠肝脑或者植物叶片）
a．600μl冰预冷的细胞核裂解液加入10-20mg新鲜或者解冻的组织用小匀浆器匀浆10秒钟，将裂解物转入1.5ml小离心管。另一种方法是用在液氮中研磨组织成细粉后，取10-20mg 组织（植物叶片可以适当多加如用40mg）转入装有600μl冰预冷的细胞核裂解液的1.
5ml离心管， 用大口径枪头吹打混匀。
b．将裂解物放置在65℃水浴15-30分钟。
2．加入rnase a（10mg/ml）1.8μl至裂解物中裂解物中至终浓度30μg/ml，颠倒混匀后37℃温育15-30分钟去除残留rna。然后室温冷却至少5分钟或者冰浴使回复到室温。
3．在回复到室温的裂解物内加入200μl蛋白沉淀液后，在涡旋振荡器上高速连续振荡混匀25秒。混匀后可能见到一些小的蛋白团块。冰浴5分钟。
由于样品体积重量小，用涡旋振荡器振荡混匀产生的剪切力并不会剪切打断基因组dna，如果用手振荡混匀，则不可以用手上下剧烈振荡混匀，只能适当力度振荡混匀，否则会剪断基因组dna，但是力度也不能太小，要保证充分混匀，将粘稠的裂解物打散开，否则dna无法和蛋白质沉淀分离开， 离心的时候会和蛋白质一起沉淀下来，造成dna丢失或者降低产量。此外混匀不充分也可能造成蛋白沉淀不充分， 最后的产物污染有较大量的蛋白质。因此建议新手还是用涡旋振荡器。
4．13，000rpm离心5分钟。这时候应该可以见到管底蛋白沉淀，也可能见到一些蛋白沉淀漂浮在液体表面。
5．小心缓慢吸取上清到一个新的1.5ml离心管中，不要吸动沉淀。
吸取上清时小心不要吸到管底的和漂浮在液体表面的蛋白沉淀，如果不小心将蛋白沉淀转入新的离心管中，可再次离心2分钟后取上清。
6．加入等体积的室温异丙醇（约600μl），颠倒30次混匀或者直到出现棉絮状（丝状）白色dna沉淀。
注意有时候棉絮状（丝状）dna颠倒混匀的时候，粘附着在盖子或者管口处，即使颠倒也不跟下来，这样导致操作者看不到沉淀，误认为没有得到dna。解决办法是略去步骤9，直接12，000rpm离心1分钟，弃上清，然后接步骤11。
7．垂直放置离心管，让白色dna沉淀自然沉到管底，然后尽可能多的吸弃大部分的上清，注意不要吸到沉淀。
如果棉絮状（丝状）dna沉淀附着有气泡，则会漂浮在液体表面，而不会沉淀下来，要小心避开沉淀吸取上清，不要把沉淀给吸掉了。
8．加入1ml70％乙醇后，颠倒漂洗dna沉淀，12，000rpm离心1分钟，在管底可以见到白色的dna沉淀块，倒弃上清。
9．加入0.5ml70％乙醇，颠倒几次漂洗dna沉淀，12，000rpm离心1分钟， 倒去上清（注意不要把dna沉淀倒掉了），倒置后在吸水纸上轻敲几下以控干残留乙醇，还可以用枪头小心吸掉管底沉淀周围和管壁的残留乙醇，空气晾干沉淀几分钟。
注意不要干燥过头，否则dna极其难溶，也不能残留太多乙醇，否则乙醇可能抑制下游如酶切反应。
10．加入100μldna溶解液重新水化溶解dna沉淀，轻弹管壁混匀，可以放置在65℃温育30-60分钟（不要超过一小时），中间不时的轻弹管壁帮助重新水化dna。也可以在室温或者4℃放置过夜来重新水化dna。
11. dna可以存放在2-8℃，如果要长时间存放，可以放置在-20℃。
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