综述近年来有关大肠杆菌**的l-天冬酰胺酶的结构与功。
能、纯化工艺以及酶的修饰的研究进展。l2-天冬酰胺酶具有抗肿瘤活性，目前临床上已将其用于儿童急性淋巴细胞白血病的**，是**此类白血病的重要的药物。……
l2天冬酰胺酶( l2asparaginase , l2asp ,ec13151111) ,又名l-门冬酰胺酶或l-天门冬酰胺酶，商品名为左旋门冬酰胺酶。l-asp单独使用时，对all的有效率为60%,与长春碱(vincristine)及皮质甾类药物(corticosteroids)联合使用时，对all的有效率高达95%。另外，l-asp对单细胞白血病、淋巴肉瘤、白血病性网状内皮组织增多症以及慢性髓细胞白血病也有一定的疗效，对胰腺癌细胞的增多还有一定的抑制作用，是临床**白血病的重要药物。
l-asp抗肿瘤的作用机制在于它能够降低人体l-asp抗肿瘤的作用机制在于它能够降低人体内l-天冬酰胺和l-谷氨酰胺的浓度，这两种氨基酸是合成嘌呤环和嘧啶环的重要组成部分。肿瘤细胞缺乏天冬酰胺合成酶，不能合成l-天冬酰胺，需要摄取外源l2天冬酰胺才能存活。当外源l-天冬酰胺被分解掉时，癌细胞合成核苷酸和蛋白质的能力就会显著降低，因此l-asp能有效抑制肿瘤细胞的增殖。
有研究表明，l-asp能够选择性抑制体内ra-pamycin2靶标信号传导(rapamycin-targeted sig-naling pathway) ,从而。
抑制肿瘤的增值。另有文献报道，l-asp在体内发挥作用时可能是通过一种功能性的p53蛋白因子来介导肿瘤细胞的凋亡。
目前，国内临床上应用的l-asp主要**于大肠杆菌，我国天津生化厂于2024年开始生产天冬酰胺酶，但由于菌种产酶能力低，提取精制工艺落后，难以与国外产品竞争，再加之其他原因最后停产。为了填补国内空白，2024年，中国药科大学吴梧桐教授等[5 ]率先进行了天冬酰胺酶ansb基因的兊隆和表达研究，并首次在国内成功构建了高效表达l-asp的基因工程菌pka/ cpu210009 ,工程菌发酵单位比野生株高出100倍。随后又优化了基因工程菌的培养条件和发酵工艺，确定了重组l-asp的纯化路线，并对重组产品进行了鉴定。
结果表明，基因工程菌生产的产品质量与天然品从基因序列、蛋白质一级结构到蛋白质的物理化学性质等方面均一致，两者具有同质性。这些研究成果为我国工业化生产优质、低价的注射用开辟了新的道路。l-asp的结构：
l-asp是由四个相同亚基(a、b、c、d)组成的同型四聚体，有222个对称轴，在ab或cd之间存在6对相互作用力，形成两对二聚物，所以更准确地说l-asp是两个二聚物的二聚体。它的每个亚基含有326个氨基酸残基，包括n端和c端两个α/β结构域。两个结构域之间由一段连接序列相连。。
l2天冬酰胺酶菌株培养1材料和方法1-1质粒和菌种。
含l2天冬酰胺酶基因的重组质粒pasn ,工程菌株jm105(pasn)、tg1 (pasn)、dh5α(pasn)、as11357 (pasn)由本实验室构建。1-2培养基及菌种。
斜面培养基：牛肉膏蛋白胨培养基。
液体培养基：牛肉膏蛋白胨培养基、蛋白胨酵母浸膏培养基。菌种 s1. 5881-3菌体制备。
从平皿上挑一单菌落接入2ml lb培养基(amp100μg/ml) ,30℃摇荡过夜，将菌液转到50ml lb培养基中，30℃摇荡培养，当菌体生长到一定生物量时，立即转到42℃诱导3h ,离心收集菌体(4℃,5min ,8 000r/ min) ,并将菌体悬浮于硼酸缓冲液中(011mol/ lph8. 4)。1-4酶活力测定仪器和试剂。
hya恒温摇床， spx280型生化培养箱，hs225c型酸度计， 721分光光度计。磷酸氢二钾，四硼酸钠，碘化钾，三羟甲基氨基甲烷，甘氨酸，以上试剂均为分析纯，葡萄糖，l2天冬酰胺，蛋白胨，牛肉膏。
实验方法。1-4-1l-天冬酰胺酶活力的测定。
1)操作方法。取0. 50 ml 0.
04mo l/ll-天冬酰胺， 0. 25ml不同介质的缓冲液， 0. 25ml发酵液(细胞悬浮液) ,在37℃下反应15 m in,加0.
25 ml三氯乙酸终止反应，离心，取上清液，加入3. 50 ml蒸馏水和1. 0ml奈氏试剂， 15m in后于500 nm波长处比色测定产生氨的吸光度值。
2)温度实验。改变温度(25～60℃) 在ph8. 00的甘氨酸缓冲液中按1. 4. 1 (1)实验方法操作。
3)酶活力单位。每分钟催化l2天冬酰胺水解生成1l/mo l氨所需的酶量。
1-4-2大肠杆菌菌株的培养。
1)培养基的选择。菌种经斜面培养后接种到不同的液体培养基中，于37℃, 250 r/m in下培养16 h,测定各发酵液的酶活力。
2)培养方法。每试管加相同培养基4. 0 ml ,菌液0. 25 ml.250 r/m in下改变温度或37℃下分别改变ph、转速，培养16h,测定各管发酵液酶活力。
3)产酶曲线的绘制。菌株在液体培养基中于37℃, 250 r/min, ph 7. 00下培养，每隔1 h取发酵液测其酶活力。l-天冬酰胺酶的提纯2-1实验材料。
从大肠杆菌as1.357的培养基中离心沉淀菌体，然后用4倍体积的冷丙酮处理，过滤，吹干，粉碎。1---2---
重组天门冬酞胺酶ii纯化过程的毛细管电泳监测法仪器和方法：3---
问题及展望。
自l-asp应用于临床以来，白血病患者，特别是all患者的长期无病生存率得到了明显的提高。同时，在l-asp结构与功能上的研究也取得了惊人的进展，但是仍然存在不少目前未能解决的问题，特别是l-asp在临床应用过程中发生的不良反应是最值得关注的问题，如进行性免疫反应、全身性过敏反应、急性胰腺炎、高血压及血液系统异常等。综观种类繁多的化学修饰、包埋和固定化，它们共同的缺陷在于：
①使克疫原性降低的同时，酶活力**率也比较低；修饰物、微囊化型包埋材料的生物无害降解性和生物相容性有待解决。基因修饰特别是基因。
内修饰能避免上述缺陷，在不影响酶活力的前提下，降低l2asp的抗原性，有望为l-asp的安全有效使用开辟新天地。
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