实验室啤酒发酵。
一、 实验目的：熟悉静止培养操作，学习酵母菌种分离纯化与质量鉴定，观察啤酒发酵过程，掌握发酵过程中一些指标的分析操作技能。
二、 实验原理：见各试验。
三、实验器材：
试验仪器：见各实验。
培养基：1. 麦芽汁发酵培养基10 plato, 50升，糖化制取。
2. 麦芽汁琼脂培养基：麦芽汁加2％琼脂，自然ph。
3. 麦芽汁液体培养基：酵母扩大培养用。
菌种：啤酒生产用酵母菌株。
四、实验步骤：
1）麦汁制备
2）酵母菌种分离纯化与质量鉴定
3）菌种扩大培养。
4）啤酒主发酵：
5）后发酵。
6）各项指标测定。
实验一协定法糖化试验。
一、实验目的：协定法糖化试验是欧洲啤酒酿造协会（ebc）推荐的评价麦芽质量的标准方法，我们用该法进行小量麦芽汁制备，并借此评价所用麦芽的质量。
二、实验原理：利用麦芽所含的各种酶类将麦芽中的淀粉分解为可发酵性糖类，蛋白质分解为氨基酸（具体参见《发酵工程试验指导》）。
三、实验器材和试剂：
1 实验室糖化器：由水浴和500~600 ml的烧杯组成糖化仪器，杯内用玻棒搅拌或用100℃温度计作搅拌器（此时搅拌应十分小心，以免敲碎水银头）。实验时杯内液面应始终低于水浴液面。
最好采用专用糖化器：该仪器有一水浴，水浴本身有电热器加热和机械搅拌装置。水浴上有4~8个孔，每个孔内可放一糖化杯，糖化杯由紫铜或不锈钢制成，每一杯内都带有搅拌器，转速为80~100转/分，搅拌器的螺旋桨直径几乎与糖化杯同，但又不碰杯壁，它离杯底距离只有1~2 mm。
2 白色滴板或瓷板，玻棒或温度计。
3 滤纸，漏斗，电炉。
4 碘溶液，0.02n： 2.5克碘和5克碘化钾溶于水中，稀释到1000毫升。
四、实验步骤。
1. 协定法糖化麦汁的制备。
1）取50g麦芽，用植物粉碎机将其粉碎。
2）在已知重量的糖化杯（500~600 ml烧杯或专用金属杯）中，放入50g麦芽粉（a只放50g麦芽；b50g麦芽加10g淀粉；c50g麦芽加20g淀粉；d50g麦芽加30g淀粉），加200ml 46~47℃的水，于不断搅拌下在45℃水浴中保温30分钟。
3）使醪液以每分钟升温1℃的速度，升温加热水浴，在25分钟内升至70℃。此时于杯内加入100 ml 70℃的水。
4）70℃保温1小时后，在10~15分钟内急速冷却到室温。
5）冲洗搅拌器。擦干糖化杯外壁，加水使其内容物准确称量为450g。
6）用玻棒搅动糖化醪 ，并注于干漏斗中进行过滤，漏斗内装有直径20厘米的折叠滤纸，滤纸的边沿不得超出漏斗的上沿。
7）收集约100ml滤液后，将滤液返回重滤。过30分钟后，为加速过滤可用一玻棒稍稍搅碎麦槽层。将整个滤液收集于一干烧杯中。在进行各项试验前，需将滤液搅匀。
2. 糖化时间的测定。
在协定法糖化过程中，糖化醪温度达70℃时记录时间，5分钟后用玻棒或温度计取麦芽汁1滴，置于白滴板（或瓷板）上，再加碘液1滴，混合，观察颜色变化。
每隔5分钟重复上述操作，直至碘液呈黄色（不变色）为止，记录此时间。
由糖化醪温度达到70℃开始至糖化完全无淀粉反应时止，所需时间为糖化时间。报告以每5分钟计算：如 <10分钟10~15分15~20分钟等。
正常范围值：浅色麦芽：15分钟内；深色麦芽：35分钟内。
3. 过滤速度的测定。
以从麦汁返回重滤开始至全部麦芽汁滤完为止所需的时间来计算，以快、正常和慢等来表示，1小时内完成过滤的规定为“正常”，过滤时间超过1小时的报告为“慢”。
4. 气味的检查。
糖化过程中注意糖化醪的气味。具有相应麦芽类型的气味规定为“正常’,因此对深色麦芽若有芳香味，应报以“正常”；若样品缺乏此味，则以“不正常”表示，其它异味亦应注明。
5. 透明度的检查。
麦汁的透明度用透明、微雾、雾状和混浊表示。
6. 蛋白质凝固情况检查。
强烈煮沸麦芽汁5分钟，观察蛋白质凝固情况。在透亮麦芽汁中凝结有大块絮状蛋白质沉淀，记录为“好”；若蛋白质凝结细粒状，但麦汁仍透明清亮，则记录为“细小”；若虽有沉淀形成，但麦芽汁不清，可表示为“不完全”；若没有蛋白质凝固，则记录为“无”。
五、注意事项：
粉碎最好用ebc粉碎机，若用1号筛粉碎，细粉约占90%，用2号筛粉碎细粉约占25%。对溶解度好的麦芽，建议用2号筛。因为细粉太多影响过滤速度。
一般要求粗粒与细粒(包括细粉)的比例达1：2.5以上。
麦皮在麦汁过滤时形成自然过滤层，因而要求破而不碎。如果麦皮粉碎过细，不但会造成麦汁过滤困难，而且麦皮中的多酚、色素等溶出量增加，会影响啤酒的色泽和口味。但麦皮粉碎过粗，难以形成致密的过滤层，会影响麦汁浊度和得率。
麦芽胚乳是浸出物的主要部分，应粉碎得细些。
为了使麦皮破而不碎，最好稍加回潮后进行粉碎。
6、思考题：糖化过程中麦芽中各种酶的作用。
实验二麦芽汁的制备。
一、实验目的： 熟悉麦芽汁的制备流程，为啤酒发酵准备原料。
二、实验原理：麦汁制备包括原料糖化、麦醪过滤和麦汁煮沸等几个过程。由于麦芽的**相对较高，再加上发酵过程中需要较多的糖，因此目前大多数工厂都用大米做辅料。
三、实验器材：在糖化车间一般有四种设备：糊化锅、糖化锅、麦汁过滤槽和麦汁煮沸锅，本实验由于受条件限制，只能采用单式设备，即将糊化锅、糖化锅和麦汁煮沸锅合而为一。
四、实验步骤：
1. 糖化用水量的计算。
糖化用水量一般按下式计算：w=a（100—b）/b
式中b为过滤开始时的麦汁浓度（第一麦汁浓度）
a为100kg原料中含有的可溶性物质（浸出物重量百分比）
w为100kg原料（麦芽粉）所需的糖化用水量（升）。
例：我们要制备60升10度的麦芽汁，如果麦芽的浸出物为75%，请问需要加入多少麦芽粉？
因为w=75（100—10）/10=675升。
即100kg原料需675升水，则要制备60升麦芽汁，大约需要添加10kg的麦芽和60升左右的水（不计麦芽溶出后增加的体积）。
2. 糖化。
糖化是利用麦芽中所含的酶，将麦芽和辅助原料中的不溶性高分子物质，逐步分解为可溶性低分子物质的过程。制成的浸出物溶液就是麦芽汁。
传统的糖化方法主要有两大类，1）煮出糖化法：利用酶的生化作用及热的物理作用进行糖化的一种方法。
2）浸出糖化法：纯粹利用酶的生化作用进行糖化的方法。
本实验采用浸出糖化法。推荐使用如下流程：
35~37℃，保温30分钟--→50~52℃ 60分钟--→65℃ 30分钟（至碘液反应基本完全）--76~78℃ 送入过滤槽。
3. 麦汁过滤。
将糖化醪中的浸出物与不溶性麦糟分开，以得到澄清麦汁的过程。由于过滤槽底部是筛板，要借助麦糟形成的过滤层来达到过滤的目的，因此前30分钟的滤出物应返回重滤。头号麦汁滤完后，应用适量热水洗糟，得到洗涤麦汁。
4. 麦汁煮沸过滤。
将过滤后的麦汁加热煮沸以稳定麦汁成分的过程。此过程中可加入酒花（一种含苦味和香味的蛇麻之花，每100升麦汁中添加约200克）。
煮沸的具体目的主要有：破坏酶的活性；使蛋白质沉淀；浓缩麦汁；浸出酒花成分；降低ph；蒸出恶味成分；杀死杂菌；形成一些还原物质。
添加酒花的目的主要有：赋予啤酒特有的香味和爽快的苦味；增加啤酒的防腐能力；提高啤酒的非生物稳定性。
将过滤的麦汁通蒸汽加热至沸腾，煮沸时间一般控制在1.5~2小时，蒸发量达15~20%（蒸发时尽量开口，煮沸结束时，为了防止空气中的杂菌进入，最好密闭）。
煮沸后过滤备用。
5. 糖度测定使用糖度计。
采用手持式糖度计测定糖度。
五、注意事项：
过滤时间可能较长，此过程可做酵母计数及质量检查。
六、思考题：麦芽粉碎程度会对过滤产生怎样的影响？
实验三啤酒酵母的计数。
一、实验目的：学习用血球计数板计数酵母数量的方法，一、 实验原理：啤酒发酵时，必须接入一定数量的酵母细胞；在发酵过程中，为了跟踪发酵的进程，判断发酵是否正常，也有必要测定悬浮酵母细胞的浓度。
酵母菌的计数常用血球计数板方法。血球计数板是一块长方形的玻璃板，被四条凹槽分隔成三个部分，中间部分又被一横槽隔成上下两半，每一半上各刻有一个方格网，方格网的边长为3mm,分为9个正方形大格，每一大格为1mm2,其中中间那个大格被横向和纵向的双线分成25（或16）个中格，每个中格又被单线分成16（或25）个小格，因此一个大格中共有25×16=400个小格。这样的一个大格就是一个计数室。
由于计数室比板表面要低0.1mm,因此盖上盖玻片后，整个计数室的容积就是0.1 mm3,相当于0.
0001ml。
计数时，先让计数室中充满待检溶液，然后计数400个小格中的细胞总数，就可换算出1ml发酵液中的总菌数。
三、实验器材：显微镜，血球计数板，盖玻片等。
四、实验步骤：
1. 取清洁的血球计数板一块，平放于桌面上，在计数室上方加盖专用盖玻片；
2. 取酵母菌液（发酵液）一小滴，滴至盖玻片的边缘，让菌液渗入计数室内，注意计数室内不能留有气泡。
3. 静置5分钟，让酵母细胞稳定附着于计数室内；
4. 将计数板置于显微镜的载物台上，先用低倍镜找到计数板的方格网，并移至视野中间（寻找时可通过缩小光圈，降低聚光镜，开低电源电压等方式减少进光量，使视野稍偏暗）；
5. 找到计数室位置（中间一个大方格），并看清由双线包围的中方格（16或25格）及由单线包围的小方格（共400格）；
6. 计数大格内的酵母细胞总数，必要时可在高倍镜下观察。
若酵母细胞过多，可采取。
1）：稀释后再计数；
2）：有代表性地选择左上，左下，右上，右下，中间五个中方格，计数其内的菌数，求得每个中格的平均值，然后乘以中方格数（25或16），即得每个大格内的细胞总数；
3）：在上述5个中方格中选择处于顶角的4个小方格，计数，计算20个小方格中的总菌数，再乘以20，即得大格内的细胞总数。
7. 计算：
酵母细胞数/ml=大格中的细胞总数×10000×稀释倍数。
8. 血球计数板的清洗：
将血球计数板立即用流水冲洗干净，若菌液变干，酵母细胞被固定在计数板上，则很难用流水冲洗干净，必须用优质脱脂棉湿润后轻轻擦洗，再用流水冲洗干净，凉干。
五、注意事项：
1. 血球计数板的计数室内刻度非常精细，清洗时切勿用试管刷或其它粗糙物品擦拭。
2. 加样前，应先放好盖玻片，让菌液自然吸入。如果先加菌液，则由于盖玻片较轻，可能会浮在菌液上，这样，计数室内的容积就不再使0.
0001ml了。因此，为了使结果更加准确，最好不要用普通的盖玻片来替代。
3. 计数时，为避免重复或遗漏，对压在方格线上的细胞，应遵循数上不数下，数左不数右的原则（即凡压在上部或左面线上的细胞，都应计数入内，凡压在下部或右面线上的菌体，都应忽略不计）。对出芽细胞，如果子细胞大于母细胞的一半，则应算作两个细胞。
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